磷脂酶C（PLC）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號(hào)：BC2425

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液配制：

1．提取液二：試劑易揮發(fā)，用完后快速擰蓋，封口封纏口。

2．標(biāo)準(zhǔn)品：5μmol/mL對硝基苯*溶液。

3．提取液的配制：臨用前根據(jù)樣本量將提取液一與提取液二1:1混合，切勿一次性全部混合，用多少配多少。

產(chǎn)品說明：

磷脂酶C（EC 3.1.4.3）是一種水解甘油磷酸酯C3位點(diǎn)甘油磷酸酯鍵的脂類水解酶，廣泛存在于微生物及動(dòng)植物的組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞代謝、細(xì)胞傳遞、生長發(fā)育等方面具有重要作用。

磷脂酶C催化水解NPPC產(chǎn)生對硝基苯*，在410nm處有特征吸收峰。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、超速冷凍離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、天平、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、蒸餾水、冰。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例加入提取液，建議稱取約0.1g樣本，加入1mL提取液，冰浴勻漿后于4℃，10 000g離心5min；取全部上清再于4℃、100 000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。

2、 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后于4℃，10 000g離心5min；取全部上清再于4℃、100 000g離心30min，棄上清，取沉淀溶于1mL試劑一。

3、 血清（漿）：直接測定。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長到410nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2、 標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋：將5μmol/mL對硝基苯*溶液用蒸餾水稀釋至1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.02、0.01μmol/mL。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表：

備注：實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需20µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

4、 樣本測定：（在EP管或者96孔板中加入下列試劑）

三、酶活計(jì)算

1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線：

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（x，μmol/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度ΔA標(biāo)（y）為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA帶入公式中計(jì)算濃度x（μmol/mL）。

2、 酶活測定：

（1）按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對硝基苯*所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLC活性 (U/mg prot) = x×V樣÷(V樣×Cpr) ÷T = 0.033× x÷ Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：每克組織每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對硝基苯*所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLC活性 (U/g 質(zhì)量) = x×V樣總÷W÷T = 0.033× x÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對硝基苯*所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLC活性(U/10⁴ cell）= x×V樣總÷細(xì)胞數(shù)量÷T= 0.033× x÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按血清（漿）體積計(jì)算：

酶活定義：每毫升血清每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對硝基苯*所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLC活性（U/mL）= x÷T = 0.033× x

V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入的試劑一體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；細(xì)胞數(shù)量：以萬計(jì)；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。

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