肌酐（Cr）含量檢測試劑盒說明書（肌氨酸氧化酶法）

微量法

貨號：BC4915

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前每支加入1.1 mL蒸餾水，充分溶解。用不完的試劑-20℃分裝保存兩周。

2. 試劑二：臨用前每支加入1.05 mL蒸餾水，充分溶解。用不完的試劑-20℃分裝保存兩周。

3. 試劑三：臨用前每支加入1 mL蒸餾水（100T/96S），充分溶解。為方便儲存故多給一支。用不完的試劑-20℃分裝保存兩周。

4. 試劑三工作液：根據(jù)試驗所需用量，按照試劑三 : 蒸餾水=1:9的比例，充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

5. 試劑四：臨用前加入1 mL蒸餾水，充分溶解。用不完的試劑-20℃分裝保存兩個月。

6. 試劑五：臨用前每支加入2.2 mL蒸餾水，充分溶解。用不完的試劑-20℃分裝保存兩周。

7. 試劑六：臨用前根據(jù)實驗所需用量，按照試劑六A液：試劑六B液=1:1的比例，充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配

8. 標(biāo)準(zhǔn)品：1 mg肌酐。臨用前加入1 mL蒸餾水，充分溶解，即1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，2-8℃保存一個月。臨用前將其稀釋至200μg/mL作為標(biāo)準(zhǔn)液待測。

產(chǎn)品說明：

肌酐（creatinine，Cr），化學(xué)式是C₄H₇N₃O，是肌肉在人體內(nèi)代謝的產(chǎn)物，主要由腎小球濾過排出體外。血中肌酐來自外源性和內(nèi)源性兩種，外源性肌酐是肉類食物在體內(nèi)代謝后的產(chǎn)物；內(nèi)源性肌酐是體內(nèi)肌肉組織代謝的產(chǎn)物。

樣品中的肌酐在肌酐酶的催化下水解生成肌酸。在肌酸酶的催化下肌酸水解生成肌氨酸和尿素。肌氨酸在肌氨酸氧化酶的催化下氧化產(chǎn)生過氧化氫。過氧化物酶催化過氧化氫氧化4-氨基安替*林偶聯(lián)酚，生成有色化合物，在505nm 有特征吸收峰。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、超聲破碎儀。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、 細(xì)菌、細(xì)胞樣本的制備：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1 mL提取液一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300W，超聲3秒，間隔9秒，總時間5 min）；于4℃，12000 g離心10 min，取0.8 mL上清液，再加入0.15 mL提取液二，混勻，4℃，12000 g離心10 min后取上清待測。

2、 組織樣本的制備：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000 g離心10 min，取0.8 mL上清液，再加入0.15 mL提取液二，混勻，4℃，12000 g離心10 min后取上清待測。

3、 血清（漿）：取100 μL血清（漿）加入1 mL提取液一，4℃，12000 g離心10 min，取0.8 mL上清液，再加入0.15 mL提取液二，4℃，混勻，12000 g離心10 min后取上清待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至505 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 按下表步驟加樣：

注：空白管只需做1-2次。

三、肌酐含量計算

1、 計算公式

（1）按照蛋白濃度計算

肌酐含量（μg/mg prot）= C標(biāo)×ΔA測÷ΔA標(biāo)×V樣÷（V樣×Cpr）=200×ΔA測÷ΔA標(biāo)÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

肌酐含量（μg/g 質(zhì)量）= C標(biāo)×ΔA測÷ΔA標(biāo)×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）

= 237.5×ΔA測÷ΔA標(biāo)÷W

（3）按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算

肌酐含量（μg/10⁴ cell）= C標(biāo)×ΔA測÷ΔA標(biāo)×（V上清+V提取液二）÷（細(xì)胞數(shù)量×V上清÷V提取液一）

= 237.5×ΔA測÷ΔA標(biāo)÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按照血清（漿）體積計算

肌酐含量（μg/mL）= C標(biāo)×ΔA測÷ΔA標(biāo)×(V上清+V提取液二)÷ [V液體×V上清÷(V提取液一+V液體)]

= 2612.5×ΔA測÷ΔA標(biāo)

C標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，200 μg/mL；V樣：加入樣本體積，20 μL=0.02mL；V上清：提取時上清液體積，0.8 mL；V提取液一：加入提取液一體積，1 mL；V提取液二：加入提取液二體積，0.15 mL；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；細(xì)胞數(shù)量：以10⁴計；V液體：液體樣本體積，0.1 mL。

注意事項：

1、提取液中含有蛋白沉淀劑，提取的上清液不能用于蛋白濃度的測定。若想要用蛋白濃度計算肌酐含量需要另取樣本，即取相同質(zhì)量的組織、同等數(shù)目的細(xì)菌或細(xì)胞，用1.1875mLPBS（生理鹽水）勻漿；取相同體積的血清（漿），用1.206mLPBS（生理鹽水）勻漿（相當(dāng)于提取步驟最終樣本上清液），用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定。

2、如果測定吸光值超過標(biāo)準(zhǔn)管吸光值，建議用蒸餾水稀釋樣本后再進(jìn)行測定。如果ΔA測定小于0.01，建議增大樣本量后再進(jìn)行測定。

實驗實例：

1、 取0.1g小鼠肌肉加入1mL提取液一進(jìn)行勻漿研磨離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清后按照測定步驟操作，用96孔板測定后計算ΔA測=A測定-A空白=0.199-0.054=0.145，ΔA標(biāo)= A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.483-0.054= 0.429。按樣本質(zhì)量計算含量得：

肌酐含量（μg/g 質(zhì)量）=237.5×ΔA測÷ΔA標(biāo)÷W=802.7μg/g 質(zhì)量。

2、 取100μL牛血清加入1mL提取液一，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清，之后按照測定步驟操作，用96孔板測定后計算ΔA測=A測定-A空白=0.138-0.054=0.084，ΔA標(biāo)= A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.483-0.054= 0.429。按照液體體積計算含量得：

肌酐含量（μg/mL）= 2612.5×ΔA測÷ΔA標(biāo)= 511.5 μg/mL血清。

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