5'-核苷酸酶（5'-NT）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC4595

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制： 

1、 試劑五：臨用前加入4 mL蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑2-8℃保存兩周。

2、 試劑六：臨用前加入4 mL蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑2-8℃保存兩周。

3、 工作液配制：臨用前取1支試劑一中加入到1瓶試劑二中充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存一周，現(xiàn)用現(xiàn)配。

4、 定磷試劑的配制：按H₂O：試劑五：試劑六：試劑七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染（請根據(jù)需要，用多少配多少）。

5、 標(biāo)準(zhǔn)品：8 mg 磷標(biāo)準(zhǔn)品。臨用前加入4.6 mL試劑四溶解配制成10 μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，溶解后2-8℃保存。

產(chǎn)品說明：

5'-核苷酸酶(5'-NT)是一種對底物特異性不高的水解酶，可作用于多種核苷酸。廣泛存在于各種植物、動物組織、血清血漿中。5'-NT是一種特殊的磷酸酯水解酶，它作用于核苷-5'-磷酸如AMP(腺苷-5'-磷酸或腺苷酸)生成無機磷酸和核苷。通過定磷顯色法測定所生成的無機磷含量，可以計算出5'-NT的活性高低。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

天平、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、低溫離心機、恒溫水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照質(zhì)量（g）﹕提取液體積(mL)為 1﹕5-10 的比例（建議稱取約0.05 g，加入0.5 mL提取液），冰上勻漿后于4℃，15000 g 離心10 min，取上清置于冰上待測。

2. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）﹕蒸餾水體積（mL）為500-1000﹕1 的比例（建議500萬個細(xì)胞加入0.5 mL 蒸餾水），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300 W，超聲3 s，間隔7 s，總時間3 min）；然后4℃，15000 g 離心10 min，取上清置于冰上待測。

3. 血清：直接檢測。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至660 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 將標(biāo)準(zhǔn)品用試劑四稀釋至0.96、0.48、0.24、0.12、0.06、0.03、0.015 μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表

實驗中每個標(biāo)準(zhǔn)管需80µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

4、 操作表（在1.5 mL EP管中操作）

（1） 酶促反應(yīng)

（2） 顯色反應(yīng)

三、5'-NT活性計算

1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

以各個標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸，其對應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y= kx+b，將ΔA帶入方程得到x（μmol/mL）。

2、 5'-NT活性的計算

（1）按樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。

5'-NT酶活（U/mg prot）=x×V反總÷(V樣×Cpr)÷T×10³=333.3×x÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每克組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機磷定義為一個酶活單位。

5'-NT酶活（U/g 質(zhì)量）=x×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T×10³=166.67×x÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)計算：

酶活單位定義：每10⁴個細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。

5'-NT酶活（U/10⁴ cell）=x×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T×10³=166.67×x÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計算：

酶活單位定義：每毫升液體在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。

5'-NT酶活（U/mL）=x×V反總÷V樣÷T×10³=333.3×x

V樣：酶促反應(yīng)中加入樣本體積，0.02 mL；V反總：酶促反應(yīng)總體積，0.2 mL；V樣總：加入提取液的體積，0.5 mL；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；細(xì)胞數(shù)量：以萬計；T：酶促反應(yīng)時間，30 min；10³：單位換算，1 μmol=10³ nmol。

注意事項：

1. ΔA測定大于1或者A測定管大于1時，建議將樣本用試劑四稀釋后再進(jìn)行測定。

實驗實例：

1、取0.05g小鼠肝，進(jìn)行樣本處理，取上清后按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定管=A測定-A對照=0.449-0.334=0.115，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.5514x+0.0038，計算x=0.0717，按照樣本質(zhì)量計算酶活得：

5'-NT酶活（U/g 質(zhì)量）=333.3×x÷W=333.3×0.0717÷0.1=238.98 U/g 質(zhì)量。

2、取0.05g稗草，進(jìn)行樣本處理，取上清后按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定管=A測定-A對照=0.245-0.196=0.049，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.5514x+0.0038，計算x=0.0291，按照樣本質(zhì)量計算酶活得：

5'-NT酶活（U/g 質(zhì)量）=333.3×x÷W=333.3×0.0291÷0.1=97.00 U/g 質(zhì)量。

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