北京索萊寶科技有限公司
專注于生物學(xué)試劑及試劑盒領(lǐng)域
服務(wù)熱線：18101056239
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產(chǎn)品型號：BC4590-50T/24S
更新時間：2024-03-22
廠商性質(zhì)：生產(chǎn)廠家
訪 問 量 ：814
010-50973130
產(chǎn)品分類
相關(guān)文章
5'-核苷酸酶（5'-NT）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
貨號：BC4590
規(guī)格：50T/24S
產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液 | 液體30 mL×1瓶 | |
試劑一 | 粉劑×2支 | |
試劑二 | 液體12 mL×2瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 液體30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體25 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑五 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑六 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑七 | 液體12 mL×1瓶 | 常溫保存 |
標準品 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑五：臨用前加入12 mL蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑2-8℃保存兩周。
2、 試劑六：臨用前加入12 mL蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑2-8℃保存兩周。
3、 工作液配制：臨用前取1支試劑一中加入到1瓶試劑二中充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存一周，現(xiàn)用現(xiàn)配。
4、 定磷試劑的配制：按H2O：試劑五：試劑六：試劑七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染（請根據(jù)需要，用多少配多少）。
5、 標準品：8 mg磷標準品。臨用前加入4.6 mL試劑四溶解配制成10 μmol/mL的標準溶液，溶解后2-8℃保存兩周。
產(chǎn)品說明：
5'-核苷酸酶(5'-NT)是一種對底物特異性不高的水解酶，可作用于多種核苷酸。廣泛存在于各種植物、動物組織、血清血漿中。5'-NT是一種特殊的磷酸酯水解酶，它只作用于核苷-5'-磷酸如AMP(腺苷-5'-磷酸或腺苷酸)生成無機磷酸和核苷。通過定磷顯色法測定所生成的無機磷含量，可以計算出5'-NT的活性高低。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
天平、可見分光光度計、臺式離心機、低溫離心機、恒溫水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1 mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1. 組織：按照質(zhì)量（g）﹕提取液體積(mL)為 1﹕5-10 的比例（建議稱取約0.1 g，加入1 mL提取液），冰上勻漿后于4℃，15000 g離心10 min，取上清置于冰上待測。
2. 細胞：按照細胞數(shù)量（104個）﹕蒸餾水體積（mL）為500-1000﹕1 的比例（建議500萬個細胞加入1 mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300 W，超聲3 s，間隔7 s，總時間3 min）；然后4℃，15000 g 離心10 min，取上清置于冰上待測。
3. 血清：直接檢測。
二、測定步驟
1、 分光光度計預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至660 nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 將標準品用試劑四稀釋至0.48、0.24、0.12、0.06、0.03、0.015 μmol/mL標準液。
3、 標準品稀釋表
序號 | 稀釋前濃度（µmol/mL） | 標準液體積（µL） | 試劑四體積（µL） | 稀釋后濃度（µmol/mL） |
1 | 10 | 48 | 952 | 0.48 |
2 | 0.48 | 500 | 500 | 0.24 |
3 | 0.24 | 500 | 500 | 0.12 |
4 | 0.12 | 500 | 500 | 0.06 |
5 | 0.06 | 500 | 500 | 0.03 |
6 | 0.03 | 500 | 500 | 0.015 |
實驗中每個標準管需400µL標準溶液。
4、 操作表（在1.5 mL EP管中操作）
（1） 酶促反應(yīng)
試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 |
樣本 | 100 | 100 |
工作液 | 400 | |
漩渦混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（植物及其他）反應(yīng)30 min | ||
試劑三 | 500 | 500 |
工作液 | - | 400 |
漩渦混勻，25℃，8000 rpm離心10 min，取上清進行顯色反應(yīng) | ||
（2） 顯色反應(yīng)
試劑名稱（μL） | 測定管 | 對照管 | 標準管 | 空白管 |
上清液 | 400 | 400 | - | - |
標準液 | - | - | 400 | - |
試劑四 | - | - | - | 400 |
定磷試劑 | 800 | 800 | 800 | 800 |
漩渦混勻，40℃顯色10 min；取1 mL反應(yīng)液于1 mL玻璃比色皿中，在660 nm下測定吸光值A，分別記為 A測定、A對照、A標準、A空白，計算ΔA標準=A標準-A空白，ΔA測定=A測定-A對照（標準曲線和空白管只需測定1-2次）。 | ||||
三、5'-NT活性計算
1、 標準曲線的繪制：
以各個標準溶液的濃度為x軸，其對應(yīng)的ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程y= kx+b，將ΔA帶入方程得到x（μmol/mL）。
2、 5'-NT活性的計算
（1）按樣本蛋白濃度計算
酶活單位定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。
5'-NT酶活（U/mg prot）=x×V反總÷(V樣×Cpr)÷T×103=333.3×x÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算
酶活單位定義：每克組織在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機磷定義為一個酶活單位。
5'-NT酶活（U/g 質(zhì)量）=x×V反總÷(W×V樣÷V樣總)÷T×103=333.3×x÷W
（3）按細胞數(shù)計算：
酶活單位定義：每104個細胞在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。
5'-NT酶活（U/104 cell）=x×V反總÷(細胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T×103=333.3×x÷細胞數(shù)量
（4）按液體體積計算：
酶活單位定義：每毫升液體在反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1 nmol 無機磷定義為一個酶活性單位。
5'-NT酶活（U/mL）=x×V反總÷V樣÷T×103=333.3×x
V樣：酶促反應(yīng)中加入樣本體積，0.1 mL；V反總：酶促反應(yīng)總體積，1 mL；V樣總：加入提取液的體積，1 mL；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；細胞數(shù)量：以萬計；T：酶促反應(yīng)時間，30 min；103：單位換算，1 μmol=103 nmol。
注意事項：
1. ΔA測定大于1或者A測定管大于1時，建議將樣本用試劑四稀釋后再進行測定。
實驗實例：
1、取0.1g小鼠肝，進行樣本處理，取上清后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管=A測定-A對照=0.723-0.534=0.189，帶入標準曲線y=2.3928x+0.0165，計算x=0.0721，按照樣本質(zhì)量計算酶活得：
5'-NT酶活（U/g 質(zhì)量）=333.3×x÷W=333.3×0.0721÷0.1=240.31 U/g 質(zhì)量。
2、取0.1g稗草，進行樣本處理，取上清后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管=A測定-A對照=0.367-0.281=0.086，帶入標準曲線y=2.3928x+0.0165，計算x=0.0290，按照樣本質(zhì)量計算酶活得：
5'-NT酶活（U/g 質(zhì)量）=333.3×x÷W=333.3×0.0290÷0.1=96.657 U/g 質(zhì)量。
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