北京索萊寶科技
專注于生物學(xué)試劑及試劑盒領(lǐng)域
服務(wù)熱線：18101056239
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產(chǎn)品型號：BC4580-50T/24S
更新時間：2024-03-22
廠商性質(zhì)：生產(chǎn)廠家
訪 問 量 ：861
010-50973130
產(chǎn)品分類
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β-淀*酶（β-AL）活性檢測試劑盒（碘-淀粉比色法）說明書
可見分光光度法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號：BC4580
規(guī)格：50T/24S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
試劑一 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體20mL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 液體40mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑一：臨用前加入20mL試劑三，置于常溫水中并加熱至煮沸，期間不斷攪拌粉劑至溶解，用不完的試劑2-8℃保存8周；
2、 標(biāo)準(zhǔn)品：10 mg淀粉標(biāo)準(zhǔn)品。臨用前加10 mL試劑三，置沸水浴中振蕩溶解，配成1 mg/mL淀粉標(biāo)準(zhǔn)液。2-8℃保存四周。
產(chǎn)品說明：
淀*酶負(fù)責(zé)水解淀粉，主要包括α-淀*酶和β-淀*酶。β-淀*酶(EC 3.2.1.2) 從淀粉的非還原端切開α-1,4糖苷鍵，生成葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖。
碘可以與未被淀*酶水解的淀粉結(jié)合，生成在570nm下有特征吸收峰的復(fù)合物，其深淺可計算出淀*酶的活力單位。α-AL耐熱不耐酸，β-AL耐酸不耐熱。根據(jù)上述特性，鈍化其中之一，就可測得另一種活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器、蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、組織：稱取約0.1g樣本，加1mL蒸餾水勻漿；勻漿后在室溫下放置提取15min，每隔5min振蕩1次，使其充分提?。?/span>6000g，常溫離心10min，吸取上清液即為淀*酶原液。
2、液體：直接檢測。（若有渾濁則離心后進行測定）
二、測定步驟
1、 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至570nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 將淀粉標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0.0015625mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。
序號 | 稀釋前濃度（mg/mL） | 標(biāo)準(zhǔn)液體積（µL） | 蒸餾水體積（µL） | 稀釋后濃度（mg/mL） |
1 | 1 | 200 | 800 | 0.2 |
2 | 0.2 | 500 | 500 | 0.1 |
3 | 0.1 | 500 | 500 | 0.05 |
4 | 0.05 | 500 | 500 | 0.025 |
5 | 0.025 | 500 | 500 | 0.0125 |
6 | 0.0125 | 500 | 500 | 0.00625 |
7 | 0.00625 | 500 | 500 | 0.003125 |
8 | 0.003125 | 500 | 500 | 0.0015625 |
實驗中每個標(biāo)準(zhǔn)管需250µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3、 按操作表依次加入各試劑：
試劑名稱（μL） | α淀*酶活力測定 | 總淀*酶活力測定 | 空白管5 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定 | |||
測定管1 | 對照管2 | 測定管3 | 對照管4 | 標(biāo)準(zhǔn)管6 | 標(biāo)準(zhǔn)空白管7 | ||
樣本 | 250 | 250 | - | - | - | - | - |
蒸餾水 | - | - | - | - | 250 | - | 250 |
標(biāo)準(zhǔn)溶液 | - | - | - | - | - | 250 | - |
70℃水浴15min左右，冷卻 | |||||||
樣本 | - | - | 250 | 250 | - | - | - |
試劑一 | 250 | - | 250 | - | 250 | - | - |
蒸餾水 | - | 250 | - | 250 | - | 250 | 250 |
于40℃恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫5min | |||||||
試劑二 | 125 | 125 | 125 | 125 | 125 | 125 | 125 |
蒸餾水 | 375 | 375 | 375 | 375 | 375 | 375 | 375 |
混勻后于1mL玻璃比色皿中測定570nm下的吸光度，從左到右分別記為A1、A2、A3、A4、A5、A6和A7，計算ΔAα=A5-（A1-A2），ΔA總=A5-（A3-A4），ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A6-A7。空白管、標(biāo)準(zhǔn)曲線只需做1-2次。
三、β-淀*酶活性計算
標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，mg/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將ΔAα測定帶入方程得到x1（mg/mL），ΔA總代入方程得到x2（mg/mL）。
2、α淀*酶活性的計算
（1）按照樣本質(zhì)量計算
單位定義：每g組織每分鐘消耗1mg 淀粉定義為1個酶活力單位。
α-淀*酶活性(U/g 質(zhì)量)=x1×V樣÷(W×V樣÷V樣總)÷T=0.2×x1÷W
（2）按照蛋白質(zhì)濃度計算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1mg淀粉定義為1個酶活性單位。
α-淀*酶活性(U/mg prot)= x1×V樣÷（V樣×Cpr）÷T=0.2×x1÷Cpr
（3）按液體體積計算：
單位定義：每mL液體每分鐘消耗1mg淀粉定義為1個酶活性單位。
α-淀*酶活性(U/mL)= x1×V樣÷V樣÷T=0.2×x1
V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.25mL；V樣總：樣本總體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，5min。
3、總淀*酶活性的計算
（1）按照樣本質(zhì)量計算
單位定義：每g組織每分鐘消耗1mg 淀粉定義為1個酶活力單位。
總淀*酶活性(U/g 質(zhì)量)=x2×V樣÷(W×V樣÷V樣總)÷T=0.2×x2÷W
（2）按照蛋白質(zhì)濃度計算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1mg淀粉定義為1個酶活性單位。
總淀*酶活性(U/mg prot)= x2×V樣÷（V樣×Cpr）÷T=0.2×x2÷Cpr
（3）按液體體積計算
單位定義：每mL液體每分鐘消耗1mg淀粉定義為1個酶活性單位。
總淀*酶活性(U/mL)= x2×V樣÷V樣÷T=0.2×x2
V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.25mL；V樣總：樣本總體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，5min。
4、β-淀*酶活性的計算
（1）按照樣本質(zhì)量計算
單位定義：每g組織每分鐘消耗1mg 淀粉定義為1個酶活力單位。
β-淀*酶活性(U/g 質(zhì)量)=淀*酶總活性-α-淀*酶活性=0.2×x2÷W-0.2×x1÷W
（2）按照蛋白質(zhì)濃度計算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1mg淀粉定義為1個酶活性單位。
β-淀*酶活性(U/mg prot)=淀*酶總活性-α-淀*酶活性=0.2×x2÷Cpr-0.2×x1÷Cpr
（3）按液體體積計算
單位定義：每mL液體每分鐘消耗1mg淀粉定義為1個酶活性單位。
β-淀*酶活性(U/mL)=淀*酶總活性-α-淀*酶活性=0.2×x2-0.2×x1
注意事項：
吸光值大于1.5或者ΔA大于0.8時，可以對樣本進行適當(dāng)稀釋后測定。
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