蘋果酸含量檢測試劑盒（WST顯色法）說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC5495

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前加入5 mL 蒸餾水混勻，可分裝后-20℃保存，避免反復凍融，-20℃保存4周； 

2. 試劑四：臨用前按試劑四：試劑四稀釋液=10μL：1mL（約40T）的比例稀釋試劑四備用，現(xiàn)用現(xiàn)配，用多少配多少；

3. 標準品：100μmol/mL 蘋果酸標準液。臨用前取10μL 100μmol/mL 蘋果酸標準液，加入240μL蒸餾水，充分混勻，配制成4μmol/mL 蘋果酸標準液；再取100μL 4μmol/mL 蘋果酸標準液，加入900μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.4μmol/mL 蘋果酸標準液使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。（實驗中每管需要20μL，為減小實驗誤差，故配制大體積）。                                                                                       

產(chǎn)品說明：

L-蘋果酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，也是蘋果酸 - 天冬氨酸穿梭的重要組成部分。 蘋果酸-天冬氨酸穿梭是氧化磷酸化的還原當量跨線粒體膜運輸過程所必需的。在低等生物體內，蘋果酸在蘋果乳酸發(fā)酵的過程中轉化為乳酸，同時產(chǎn)生CO₂。蘋果酸常用作食品和制藥工業(yè)的添加劑，蘋果酸的定量分析在啤酒、葡萄酒、奶酪和水果生產(chǎn)領域也具有至關重要的作用。

蘋果酸脫氫酶催化蘋果酸和NAD生成草酰乙酸、NADH和NH₄⁺，在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH 反應，產(chǎn)生水溶性Formazan，在450nm下有最大吸收峰，據(jù)此可計算蘋果酸含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：                                                                                                 

分析天平、研缽/勻漿器/超聲波細胞破碎儀、離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、水

浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

組織：按照質量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

細胞：按照細胞數(shù)量（10⁶個）：提取液一體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬細胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

血清（漿）等液體：取100μL液體加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，12000g離心10min后取上清待測。

注：提取液二需緩慢加入，加入后會產(chǎn)生大量氣泡，建議使用2mL EP管進行操作。

二、測定步驟

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，波長調至450nm，分光光度計用蒸餾水調零。

2. 加樣表：（按順序將下列試劑加在96孔板/1.5mL EP管中）

三、蘋果酸含量的計算

1. 按照樣本蛋白濃度計算

蘋果酸含量（μmol/mg prot）= ΔA測定×C標準÷ΔA標準×V樣本÷（V樣本×Cpr）×F

= 0.4×ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr×F

2. 按照樣本質量計算

蘋果酸含量（μmol/g 質量）= ΔA測定×C標準÷ΔA標準× (V上清+V提取液二) ÷ (W×V上清÷V提取液一) × F

= 0.475×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F

3. 按照細胞數(shù)量計算

蘋果酸含量（μmol/10⁶ cell）= ΔA測定×C標準÷ΔA標準× (V上清+V提取液二) ÷ (N×V上清÷V提取液一) ×F

= 0.475×ΔA測定÷ΔA標準÷N×F

4. 按照液體體積計算

蘋果酸含量（μmol/mL）

= ΔA測定×C標準÷ΔA標準× (V上清+V提取液二) ÷ [V液體×V上清÷ (V提取液一+V液體)] ×F

= 5.225×ΔA測定÷ΔA標準×F

C 標準：標準管濃度，0.4μmol/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.02mL；W：樣本質量，g；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測定；V上清：提取時上清液體積，0.8mL；V提取液二：加入提取液二的體積，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一體積，1mL；N：細胞數(shù)量，10⁶個；V液體：液體樣本體積，0.1mL；F：稀釋倍數(shù)。

注意事項：

1. 提取液一中含有蛋白質沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定。如需測定蛋白含量，需另取組織。

2. ΔA測定的測定范圍在0.01-1之間。如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以用蒸餾水稀釋樣本后再次測定，如果測定吸光值小于線性范圍吸光值，需要增加樣本量后再次測定，注意同步計算公式。

實驗實例：

1. 取0.1075g香蕉果肉加入1mL提取液一，冰浴勻漿后離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清后用蒸餾水稀釋8倍后按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算，ΔA測定=A測定-A對照=0.581-0.098= 0.483，ΔA標準=A標準-A空白=0.409-0.101=0.308，按樣本質量計算含量得：

蘋果酸含量（μmol/g 質量）= 0.475×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F =0.475×0.483÷0.308÷0.1075×8=55.43 μmol/g質量。

2. 取0.1033g鼠肝加入1mL提取液一，冰浴勻漿后離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清后按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算，ΔA測定=A測定-A對照=0.271-0.118=0.153，ΔA標準=A標準-A空白=0.409-0.101=0.308，按樣本質量計算含量得：

蘋果酸含量（μmol/g 質量）= 0.475×ΔA測定÷ΔA標準÷W×F =0.475×0.153÷0.308÷0.1033×1=2.28 μmol/g質量。

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