線粒體乙醛脫氫酶（ALDH2）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC5515

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前取一支試劑二加入1.5mL蒸餾水溶解，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融；

2、 試劑五：沸點(diǎn)低，在使用時(shí)保持低溫以保證正確的吸取量。用后及時(shí)封口。

3、 工作液：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照試劑一：試劑二：試劑三：試劑四：試劑五=110µL：20µL：4µL：6µL：20µL（160µL，1T）的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說(shuō)明：

線粒體乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）屬于乙醛脫氫酶蛋白家族，存在于很多組織，特別是肝臟組織內(nèi)含量較高。該酶主要參與乙醇代謝過(guò)程的第二步，在線粒體內(nèi)將乙醛氧化成羧酸，然后進(jìn)入三羧酸循環(huán)，被分解，解除乙醛對(duì)生物體的毒害作用。另外，ALDH2也可作為酯酶參與硝酸*油的代謝途徑，是硝酸*油重要的生物活性劑。

ALDH2催化乙醛和NAD⁺轉(zhuǎn)化為乙酸和NADH，利用NADH在340nm處吸光值的變化即可計(jì)算得到ALDH2的活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、分析天平、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量石英比色皿/96孔UV板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 稱(chēng)取約0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL提取液，在冰上用勻漿器或研缽進(jìn)行快速勻漿（勻漿器可上下研磨30次左右）。

2. 4℃ 600 g離心10min（如需獲得純度更高的線粒體，可將此步離心速度改為1000g）。

3. 將上清液移至另一離心管中，4℃ 11000 g離心15min，棄上清，留沉淀。

4. 在沉淀中加入400μL提取液，超聲波破碎（功率200W，超聲5秒，間隔10秒，重復(fù)15次），用于ALDH2活性測(cè)定，若用蛋白濃度計(jì)算，取20μL用于蛋白含量測(cè)定。

二、測(cè)定步驟

1、 紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，紫外分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2、 工作液37℃預(yù)熱10min。

3、 操作表：

三、ALDH2酶活計(jì)算

A 按微量石英比色皿計(jì)算：

1. 按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：每毫克蛋白每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個(gè)酶活單位。

ALDH2活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×Cpr）÷T×F=26.795×ΔA÷Cpr×F

2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：每克樣本每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個(gè)酶活單位。

ALDH2活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T×F =10.718×ΔA÷W×F

3. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：每10⁶個(gè)細(xì)胞每分鐘生成1nmol的NADH定義為1個(gè)酶活單位。

ALDH2活性（U/10⁶ cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣÷V樣總×N）÷T×F =10.718×ΔA÷N×F

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；V樣：反應(yīng)體系中加入樣本上清體積，0.04mL；V樣總：線粒體沉淀中加入提取液體積，0.4mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，需自行測(cè)定；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)胞總數(shù)，以10⁶計(jì)；T：反應(yīng)時(shí)間，30min；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol；F：稀釋倍數(shù)。

B 按96孔UV板計(jì)算：

將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔UV板光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。

注意事項(xiàng)：

1、 試劑四有毒性，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，請(qǐng)佩戴好防護(hù)用具。

2、 由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約1mg/mL），所以在測(cè)定樣本蛋白濃度時(shí)需要減去提取液本身的蛋白含量（單獨(dú)測(cè)量）。

3、 樣本ΔA大于1時(shí)，建議將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)ΔA小于0.01時(shí)，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（60min或更長(zhǎng)）來(lái)測(cè)定。計(jì)算時(shí)注意同步更改計(jì)算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1067g小鼠肝臟進(jìn)行樣本處理，用提取液稀釋4倍后，按照測(cè)定步驟操作，用96孔UV板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A2測(cè)定-A1測(cè)定=0.743-0.169=0.574，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.102-0.102=0，ΔA=ΔA測(cè)定-ΔA空白=0.574-0=0.574，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

ALDH2活性（U/g質(zhì)量）=0.574÷（6.22×10³×0.6）×10⁹×2×10^-4÷（0.04×0.1067÷0.4）÷30×4=384.388 U/g質(zhì)量。

2、 取0.1069g冬棗果肉進(jìn)行樣本處理，按照測(cè)定步驟操作，用96孔UV板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A2測(cè)定-A1測(cè)定=0.177-0.119=0.058，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.102-0.102=0，ΔA=ΔA測(cè)定-ΔA空白=0.058-0=0.058，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

ALDH2活性（U/g質(zhì)量）=0.058÷（6.22×10³×0.6）×10⁹×2×10^-4÷（0.04×0.1069÷0.4）÷30=9.692 U/g質(zhì)量。

3、 取8×10⁶個(gè)細(xì)胞進(jìn)行樣本處理，按照測(cè)定步驟操作，用96孔UV板測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A2測(cè)定-A1測(cè)定=0.160-0.109=0.051，ΔA空白=A2空白-A1空白=0.102-0.102=0，ΔA=ΔA測(cè)定-ΔA空白=0.051-0=0.051，按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算酶活得：

ALDH2活性（U/10⁶ cell）=0.051÷（6.22×10³×0.6）×10⁹×2×10^-4÷（0.04×8÷0.4）÷30=0.114 U/10⁶ cell。

參考文獻(xiàn)：

[1] Feng Liu, Xiangqin Cui, Harry Horner, et al. Mitochondrial aldehyde dehydrogenase activity is required for male fertility in maize. The Plant Cell. May 2001, 13:1063-1078

[2] Ying Hu, Jinbin Yin, Mingzhi Zheng, et al. Mitochondrial aldehyde dehydrogenase activity protects against lipopolysaccharideinduced cardiac dysfunction in rats. Molecular Medicine Reports. February 2015, 11:1509-1515

[3] Amit Joshi, Lauren Wassenhove, Kelsey Logas, et al. Aldehyde dehydrogenase 2 activity and aldehydic load contribute to neuroinflammation and Alzheimer’s disease related pathology. Acta Neuropathologica Communications. December 2019, 7:190

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