丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC5855

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入1.1mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

2、 試劑四：臨用前加入1.1mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

3、 試劑五：臨用前加入1.25mL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

4、 試劑六工作液：臨用根據(jù)樣本量按照試劑六：蒸餾水=5μL：120μL（共125μL，25T）的比例配制成，現(xiàn)配現(xiàn)用。

5、 工作液的配制：臨用前按樣本量將試劑二：試劑三：試劑四：試劑五：試劑六工作液=0.25mL：0.25mL：0.25mL：0.25mL：0.25mL（共1.25mL，約25T）配制成工作液使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說(shuō)明：

丙酮酸磷酸雙激酶（pyruvate phosphate dikinase，PPDK，EC 2.7.9.1）是C4途徑和景天科酸代謝途徑的限速酶，催化ATP、丙酮酸和Pi經(jīng)三步反應(yīng)生成磷酸烯醇式丙酮酸。該酶主要存在于C4植物的葉綠體基質(zhì)中，對(duì)光合功能具有重要調(diào)節(jié)作用。

PPDK的逆向反應(yīng)催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、AMP和PPi生成丙酮酸、ATP和Pi，乳酸脫氫酶（LDH）進(jìn)一步催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD⁺，在340nm測(cè)定NADH減少速率，據(jù)此可以計(jì)算PPDK活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔UV板、天平、低溫離心機(jī)、水浴鍋、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL提取液）

進(jìn)行冰浴勻漿。12000g，4℃離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑一37℃預(yù)熱10min.

3、 操作表：（在微量石英比色皿/96孔UV板中依次加入）

三、丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）計(jì)算公式

1. 使用96孔UV板測(cè)定：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

酶活定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘減少1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PPDK活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反×10⁹÷（Cpr×V樣）÷T×F =535.91×ΔA÷Cpr×F

（2） 按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘減少1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PPDK活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反×10⁹÷（W÷V提取×V樣）÷T×F =535.91×ΔA÷W×F

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/(mol·cm)；d：96孔板光徑，0.6cm；V反：反應(yīng)體系體積，2×10^-4L；V樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.02mL；V提取：加入提取液的體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5min；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；F：稀釋倍數(shù)；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算，1mol=10⁹nmol。

2. 使用微量比色皿測(cè)定：

將上述公式中的d=0.6cm改為d=1cm（微量比色皿光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。

注意事項(xiàng)：

1. 測(cè)定過(guò)程中樣本和工作液在冰上放置，以免變性和失活。

2. 最好兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3. 當(dāng)樣本ΔA＜0.005時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)酶促反應(yīng)時(shí)間或增大樣本量后測(cè)定；當(dāng)樣本ΔA>0.6時(shí)，可用蒸餾水稀釋上清液后測(cè)定，注意同步修改計(jì)算公式中的稀釋倍數(shù)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1014g高粱葉片加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，取上清用蒸餾水稀釋4倍后，按照測(cè)定步驟操作，用96孔UV板測(cè)得ΔA空白=A空白1-A空白2=0.754-0.749=0.005，ΔA測(cè)定=A測(cè)定1-A測(cè)定2=0.811-0.478=0.333，ΔA=ΔA測(cè)定-ΔA空白=0.333-0.005=0.328，按樣本質(zhì)量計(jì)算PPDK活性得：

PPDK活性（U/g 質(zhì)量）=535.91×ΔA÷W×F =6934.06 U/g 質(zhì)量。

2、 取0.1086g柚子葉片加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，取上清后按照測(cè)定步驟操作，用96孔UV板測(cè)得ΔA空白=A空白1-A空白2=0.754-0.749=0.005，ΔA測(cè)定=A測(cè)定1-A測(cè)定2=1.849-1.530=0.319，ΔA=ΔA測(cè)定-ΔA空白=0.319-0.005=0.314，按樣本質(zhì)量計(jì)算PPDK活性得：

PPDK活性（U/g 質(zhì)量）= 535.91×ΔA÷W×F =1549.50U/g 質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] Chris J. Chastain and others, Functional evolution of C4 pyruvate, orthophosphate dikinase, Journal of Experimental Botany, Volume 62, Issue 9, May 2011, Pages 3083–3091

[2] Chastain, C.J., Heck, J.W., Colquhoun, T.A. et al. Posttranslational regulation of pyruvate, orthophosphate dikinase in developing rice (Oryza sativa) seeds. Planta 224, 924–934 (2006).

[3] Aoyagi K, Bassham JA. Pyruvate orthophosphate dikinase in wheat leaves. Plant Physiol. 1983 Nov;73(3):853-4.

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