Caspase-6活性檢測試劑盒說明書

比色法

貨號：BC3860

規(guī)格：20T、50T、100T

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：分裝-20℃保存。

2、 試劑二：分裝-20℃保存。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品：pNA標(biāo)準(zhǔn)溶液，5 mmol/L。標(biāo)準(zhǔn)溶液在4℃條件下為渾濁狀態(tài)，溶解即可變?yōu)槌吻鍫顟B(tài)，不影響使用。

4、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液配制：取9 mL試劑一加入1 mL試劑二，充分混勻待用。（也可按照試劑一：試劑二=9:1的比例，自行配制）。

產(chǎn)品說明：

Caspase是參與細胞凋亡過程的蛋白酶家族，包含10多個成員。Caspase-6也稱Mch-2，其前體蛋白被granzyme B剪切后形成活化的caspase-6二聚體，可誘導(dǎo)細胞凋亡。Caspase-6可剪切凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白PARP，剪切核膜上關(guān)鍵蛋白Lamin A，其對于Lamin A的識別位點是VEID。

本試劑盒測定原理基于Caspase-6特異水解其多肽底物Ac-VEID-pNA (N-acetyl-Val-Glu-Ile-Asp-p-nitroanilide)，釋放出游離的硝基苯胺pNA，后者呈黃色在405 nm具有最大吸收峰，采用可見光光度比色法測定。其吸光度值對應(yīng)于Caspase-6的水解活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、100μL玻璃比色皿/96孔板、臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、培養(yǎng)細胞：先收集細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細胞數(shù)量（約10⁶個）加100 μL試劑二（若裂解不充分可提高至150-200 μL），震蕩重懸沉淀，置冰上靜置15 min，4℃，15000g離心10-15min，取上清置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑二體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL試劑二），冰浴研磨或充分剪碎，置冰上靜置15 min，4℃，15000g離心10-15min，取上清置冰上待測。 

二、測定步驟

1、 可見分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至405nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 臨用前用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將5 mmol/L pNA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至200、100、50、25、12.5、0μmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。

3、 樣本測定（在96孔板/EP管中按順序加入以下試劑）

三、Caspase-6活性計算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，μmol/L）和ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，減去濃度為0的空白管）做標(biāo)準(zhǔn)方程。將ΔA測定代入標(biāo)準(zhǔn)方程得到x（μmol/L）。

2. 按酶活性增加百分比計算

Caspase-6活性增加百分比=（實驗處理組A測定-A空白管）/（實驗對照組A測定-A空白管）×100%

該方法簡單可靠，可粗略反應(yīng)酶活性情況。

3. 按酶活計算

參考Chemicon公司的caspase酶活力單位的定義：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric pNA-substrate per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一個酶活力單位定義為當(dāng)?shù)孜镲柡蜁r，在37℃一個小時內(nèi)可以剪切1nmol pNA底物產(chǎn)生1nmol游離 pNA的酶量。這樣就可以計算出樣品中含有多少個酶活力單位的caspase酶活性。

Caspase-6活性（U/mg prot）=x×V反總÷（V樣×Cpr）÷T×10³=2x÷Cpr÷T

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.1mL=10^-4L；V樣：加入的樣本體積，0.05mL；T：反應(yīng)時間，h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；10³：單位換算系數(shù)，1μmol =10³nmol。

注意事項：

1、由于試劑二中含有還原劑（DTT），建議將樣品用水稀釋2倍后，用Bradford法測定蛋白濃度，以降低DTT對蛋白濃度測定的干擾。不建議使用BCA法測定蛋白濃度。

2、Caspase活性測定值低最常見的原因是細胞未發(fā)生凋亡或細胞量太少，其次是觀測時間不恰當(dāng)。誘導(dǎo)凋亡時，并非劑量越大時間越長Caspase活性就越高。建議設(shè)置不同劑量和時間點如0、2、4、8、16、24小時，以檢測最佳的觀察點。

3、所測樣本的值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，可用試劑二稀釋樣本后重新測定。

4、蓋緊96孔板蓋子并用封口膜密封。37 oC孵育，肉眼可見顏色變黃時的OD405值約為0.2，此時即可測定。顏色變化不明顯可延長反應(yīng)或過夜，但酶活性較強時，孵育時間過長將導(dǎo)致反應(yīng)失去線性關(guān)系。

參考文獻：

[1] Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem J, 1997, 326: 1-16.

[2] Janicke R U, Sprengart M L, Wati M R, et al. Emerging role of caspase-3 in apoptosis[J]. Cell Death and Differentiation, 1999, 6:99-104.

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