北京索萊寶科技有限公司
專注于生物學試劑及試劑盒領(lǐng)域
服務熱線：18101056239
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產(chǎn)品型號：BC4435-100T/48S
更新時間：2024-04-16
廠商性質(zhì)：生產(chǎn)廠家
訪 問 量 ：1719
010-50973130
產(chǎn)品分類
尿酸酶活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC4435
規(guī)格：100T/48S
產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體4 mL×1瓶 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體10 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體6 mL×1 瓶 | 2-8℃保存 |
標準品 | 液體102 μL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 標準品：臨用前加入898 µL蒸餾水得到1 mmol/mL的過氧*溶液，2-8℃保存4周。
2、 工作液A的配制：按照試劑二：試劑三：試劑四 = 0.85mL：2.55mL：1.7mL（共5.1mL，30S）的比例配制，用于樣本測定管、空白管及標準管的檢測。根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用，配后建議2小時內(nèi)用完（2-8℃或者冰上保存）。
3、 工作液B的配制：按照試劑二：試劑三：試劑一 = 0.85mL：2.55mL：1.7mL（共5.1mL，30S）的比例配制，用于樣本對照管的檢測。根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用，配后建議2小時內(nèi)用完（2-8℃或者冰上保存）。
產(chǎn)品說明：
尿酸酶，又名尿酸*化酶，是一種參與嘌呤降解途徑的氧化酶，可以將尿酸分解為尿囊酸素進而排出體外。尿酸為嘌呤代謝的終末產(chǎn)物，積累過多將導致痛風、腎病、心血管疾病等多種疾病的發(fā)生。尿酸酶在尿酸相關(guān)疾病的臨床檢測以及治療中有著重要意義。
尿酸酶催化尿酸分解為尿*素、CO2和H2O2，H2O2氧化亞鐵*中的Fe2+生成Fe3+，Fe3+進一步與4-氨基安*比林和酚反應生成紅色醌類化合物，在505 nm處有特征吸收峰，通過測定505 nm處的吸光值來反映尿酸酶的活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰、EP管、蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
組織：按照組織質(zhì)量（g）︰提取液體積（mL）為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液）進行冰浴勻漿，然后10000 rpm，4℃，離心10 min，取上清置于冰上待測。
細菌或細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104個）: 提取液體積（mL）為500~1000 : 1的比例（建議500萬個細菌或細胞加入1 mL提取液），冰浴超聲波破碎細菌或細胞（功率200 W，超聲3 s，間隔7 s，總時間5 min）；然后10000 rpm，4℃，離心10 min，取上清置于冰上待測。
二、測定步驟
1、 分光光度計/酶標儀預熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至505 nm，分光光度計用蒸餾水調(diào)零。
2、 將1 mmol/mL 標準液用蒸餾水稀釋為0.5 µmol/mL的標準溶液備用。標準溶液的稀釋：取20μL 1mmol/mL過氧化氫標準液，加入1980μL蒸餾水，充分混勻，配制成10μmol/mL標準液，再取50μL 10μmol/mL過氧化氫標準液，加入950μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.5μmol/mL標準液使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。（實驗中每管需要30μL，為減小實驗誤差，故配制大體積）。
3、 操作表：(在1.5 mL離心管/96孔板中)
試劑名稱（µL） | 對照管 | 測定管 | 標準管 | 空白管 |
樣本 | 30 | 30 | - | - |
標準溶液 | - | - | 30 | - |
蒸餾水 | - | - | - | 30 |
工作液A | - | 170 | 170 | 170 |
工作液B | 170 | - | - | - |
混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）恒溫培養(yǎng)箱中準確反應30 min。于微量玻璃比色皿/96孔板，測定505nm處吸光值A，分別記為A對照管、A測定管、A標準管、A空白管。計算ΔA測定=A測定管-A對照管，ΔA標準=A標準管-A空白管。每個測定管需設(shè)一個對照管，標準管和空白管只需測1-2次。 | ||||
三、尿酸酶活性計算
（1）按樣本質(zhì)量計算
酶活定義：在pH 8.8的條件下，每克樣本每小時分解尿酸產(chǎn)生 1 μmol 的H2O2定義為一個酶活力單位。
尿酸酶酶活（U/g 質(zhì)量）= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V樣本÷（W×V樣本÷V提取）÷T
= ΔA測定÷ΔA標準÷W
（2）按蛋白濃度計算
酶活定義：在pH 8.8的條件下，每毫克蛋白每小時分解尿酸產(chǎn)生 1 μmol 的H2O2定義為一個酶活力單位。
尿酸酶酶活（U/mg prot）= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V樣本÷（Cpr×V樣本）÷T
= ΔA測定÷ΔA標準÷Cpr
（3）按照細菌數(shù)量或細胞計算
酶活定義：在pH8.8的條件下，每104個細菌或細胞每小時分解尿酸產(chǎn)生 1 μmol 的H2O2定義為一個酶活力單位。
尿酸酶酶活（U/104 cell）= ΔA測定÷（ΔA標準÷C標準）×V樣本÷（N×V樣本÷V提?。?/span>÷T
=ΔA測定÷ΔA標準÷N
C標準：標準溶液濃度，0.5 µmol/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.03 mL；V提取：提取液體積，1 mL；T：酶促反應時間：0.5 h；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細菌數(shù)量（以萬計）。
注意事項：
1、 A大于1.5時，建議將樣本用提取液稀釋后再進行測定，并在計算時乘以相應的稀釋倍數(shù)。
2、 工作液A與工作液B，需根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用，配后建議2小時內(nèi)用完。工作液本身淡黃的，隨著時間的延長，會變?yōu)榧t色，如有變色，則視為失效，需重新配制。
實驗實例：
1、 取0.1g小鼠肝臟進行樣本處理，取上清稀釋4倍后按測定步驟操作，使用96孔板測定計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.804-0.285=0.519，ΔA標準=A標準管-A空白管=0.741-0.051=0.690，按樣本質(zhì)量計算酶活得：
尿酸酶酶活（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷ΔA標準÷W×4（稀釋倍數(shù)）= 0.519÷0.690÷0.1×4（稀釋倍數(shù)）=30.09 U/g 質(zhì)量。
相關(guān)系列產(chǎn)品：
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