亞鐵氧化酶（HP）活性檢測(cè)試劑盒微量法

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

儲(chǔ)存條件
2-8℃
中文名稱
亞鐵氧化酶（HP）活性檢測(cè)試劑盒微量法
有效期
6個(gè)月
單位
盒
英文名稱
Hephaestin(HP) Activity Assay Kit
檢測(cè)方法
微量法 Spectrophotometer/Microplate Reader
規(guī)格
100T/48S

產(chǎn)品型號(hào)：BC4345-100T/48S

更新時(shí)間：2024-04-16

廠商性質(zhì)：生產(chǎn)廠家

訪問量：1147

服務(wù)熱線

010-50973130

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產(chǎn)品分類

PRODUCT CLASSIFICATION

生化檢測(cè)試劑盒-微量法

水溶性物質(zhì)羥自由基清除能力血清（漿）二胺氧化酶（DAO）活性檢測(cè)盒微量法生化試劑盒

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產(chǎn)品介紹

亞鐵氧化酶（HP）活性檢測(cè)試劑盒說明書

微量法

貨號(hào)：BC4345

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

試劑名稱	規(guī)格	保存條件
試劑一	液體20 mL×1瓶	2-8℃保存
試劑二	液體3 mL×1瓶	2-8℃保存
試劑三	粉劑×1瓶	2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品	液體1 mL×1支	2-8℃保存

溶液的配制：

1、試劑三：臨用前加入6 mL蒸餾水溶解備用，用不完的試劑2-8℃保存4周。

2、標(biāo)準(zhǔn)品：9 µmol/mL的亞鐵離子標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說明：

亞鐵氧化酶（Hsphasetin，HP）是銅藍(lán)蛋白的同系物，催化亞鐵離子（Fe²⁺）氧化為三價(jià)鐵離子（Fe³⁺），從而三價(jià)鐵與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞鐵釋放。

以一定濃度的Fe²⁺為底物，在亞鐵氧化酶的催化作用下Fe²⁺被氧化為Fe³⁺，Fe²⁺與菲咯嗪形成有色復(fù)合物，在562 nm處有特征吸收峰，先計(jì)算出未被氧化的Fe²⁺的含量，進(jìn)而得出被氧化的Fe²⁺的含量，可通過Fe²⁺被氧化的速率來反映亞鐵氧化酶活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、EP管。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：按照質(zhì)量（g）︰蒸餾水體積(mL)為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1 g，加入1 mL蒸餾水）加入蒸餾水，冰浴勻漿后于10000 rpm，4℃離心10 min，取上清置于冰上待測(cè)。

2、血清或血漿：建議用蒸餾水將血清或血漿稀釋2~4倍后直接檢測(cè)。若溶液渾濁則離心取上清置于冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至562 nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2、標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋：將9µmol/mL的亞鐵離子標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水倍比稀釋為360、180、90、45、22.5、11.25、5.625 nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

3、標(biāo)準(zhǔn)液稀釋可參考下表：

序號(hào)	稀釋前濃度（nmol/mL）	標(biāo)準(zhǔn)液體積（µL）	蒸餾水體積（µL）	稀釋后濃度（nmol/mL）
1	9000	40	960	360
2	360	500	500	180
3	180	500	500	90
4	90	500	500	45
5	45	500	500	22.5
6	22.5	500	500	11.25
7	11.25	500	500	5.625

備注：實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需40µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

4、操作表：在1.5 mL離心管（分光光度計(jì)）或96孔板中依次加入下列試劑：

試劑名稱	對(duì)照管	測(cè)定管	無基質(zhì)管	空白管	標(biāo)準(zhǔn)管
蒸餾水（µL）	-	-	8	8	8
樣本（µL）	8	8	-	-	-
試劑一（µL）	112	112	112	112	112
用移液槍充分吹打混勻
試劑二（µL）	-	40	40	-	-
標(biāo)準(zhǔn)溶液（µL）	-	-	-	-	40
蒸餾水（µL）	40	-	-	40	-
混勻，37℃水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱中準(zhǔn)確反應(yīng)3 min
試劑三（µL）	40	40	40	40	40
混勻，于微量玻璃比色皿/96孔板中測(cè)定562 nm處吸光值A，分別記為A對(duì)照管，A測(cè)定管、A無基質(zhì)管、A空白管和A標(biāo)準(zhǔn)管。計(jì)算ΔA測(cè)定=（A無基質(zhì)管-A空白管）-（A測(cè)定管-A對(duì)照管），ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管，同一批次無基質(zhì)管、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)1-2次。

三、亞鐵氧化酶活性計(jì)算

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

以各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（nmol/mL）為x軸，其對(duì)應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y= kx+b，將ΔA測(cè)定帶入方程得到樣本濃度（x，nmol/mL）。

2、亞鐵氧化酶活性的計(jì)算：

（1）按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：每mg蛋白每分鐘氧化1 nmol的Fe²⁺定義為1個(gè)酶活力單位。

亞鐵氧化酶酶活（U/mg prot）= x×V試劑二÷（V樣×Cpr）÷T ×N= 1.667x÷Cpr×N

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：每g樣品每分鐘氧化1 nmol的Fe²⁺定義為1個(gè)酶活力單位。

亞鐵氧化酶酶活（U/g鮮重）= x×V試劑二÷（V樣×W÷V提?。?/span>÷T×N = 1.667x÷W×N

（3）按液體體積計(jì)算

酶活定義：每mL樣本每分鐘氧化1 nmol的Fe²⁺定義為1個(gè)酶活力單位。

亞鐵氧化酶酶活（U/mL）= x×V試劑二÷V樣÷T×N = 1.667x×N

V試劑二：加入的試劑二體積，0.04 mL；V樣：加入的樣本體積，0.008 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測(cè)定；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間：3 min；N：稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1. 當(dāng)A測(cè)定低于0.1時(shí)，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、取0.1g結(jié)腸，進(jìn)行樣本處理，按照測(cè)定操作步驟，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定 =（A無基質(zhì)管-A空白管）-（A測(cè)定管-A對(duì)照管）=（1.144-0.041）-（1.114-0.048）=0.037，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.0031x - 0.0007，計(jì)算x=11.710，按照樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

亞鐵氧化酶酶活（U/g質(zhì)量）= 1.667×x÷W×N= 1.667×11.710÷0.1=195.161 U/g質(zhì)量。

2、取兔血清，按照測(cè)定操作步驟，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=（A無基質(zhì)管-A空白管）-（A測(cè)定管-A對(duì)照管）=（0.577-0.048）-（1.114-0.048）=0.574，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 0.0031x - 0.0007，計(jì)算x=184.935，按照液體體積計(jì)算酶活得：