植物類胡蘿卜素含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào): BC4335

規(guī)格: 100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

提取液：自備80%丙 酮，將丙 酮：蒸餾水（V:V）=4:1混合待用，提供一個(gè)125mL空瓶。

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

類胡蘿卜素(carotenoid)是一類重要的天然色素的總稱，普遍存在于動(dòng)物、高等植物、真菌、藻類的黃色、橙紅色或紅色的色素之中。類胡蘿卜素是體內(nèi)維生素A的前體，同時(shí)還具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗癌、減輕心血管疾病及著色劑等作用。

植物的類胡蘿卜素存在于各種黃色質(zhì)體或有色質(zhì)體內(nèi)；如黃葉，黃色花卉，黃色和紅色的果實(shí)和黃色塊根等組織，樣本通過(guò)溶劑萃取，分離提取類胡蘿卜素，在440±10nm處有特殊吸收峰。

大部分高等植物和藻類微生物的葉綠體內(nèi)也含有類胡蘿卜素，類胡蘿卜素主要吸收藍(lán)紫光，而葉綠素a和葉綠素b既吸收紅光又可吸收藍(lán)紫光。所以針對(duì)含葉綠體的組織，為排除葉綠素a和葉綠素b對(duì)類胡蘿卜素的干擾，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式先計(jì)算出葉綠素a和葉綠素b的含量，再進(jìn)一步得出類胡蘿卜素的含量；針對(duì)不含葉綠素的組織可以直接根據(jù)類胡蘿卜素的經(jīng)驗(yàn)消光系數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、微量玻璃比色皿/96孔板（非聚苯乙烯材質(zhì)）、天平、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、10 mL離心管/試管、蒸餾水和丙 酮。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、新鮮植物葉片（去掉中脈）或其他組織用蒸餾水洗干凈，然后吸干表面水分，稱取約0.1g，剪碎放入研缽或勻漿器中。

2、加入1mL蒸餾水，少量試劑一（約10mg），在黑暗或弱光條件下充分研磨，轉(zhuǎn)入10mL離心管或試管中。

3、用提取液沖洗研缽或勻漿器，將所有沖洗液轉(zhuǎn)入10mL離心管或試管中，用提取液定容至10mL，置于黑暗條件或者包上錫箔紙浸提3h（期間可以顛倒混合2次），觀察底部組織殘?jiān)咏诎咨珓t提取全，若組織殘?jiān)慈儼祝^續(xù)浸提至組織殘?jiān)伾咏诎咨?/span>

二、測(cè)定步驟

A、黃色或其他非綠色組織（不含葉綠體）類胡蘿卜素含量測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至440nm，分光光度計(jì)用提取液調(diào)零。

2、樣本檢測(cè)（微量玻璃比色皿檢測(cè)不用測(cè)空白管，用96孔板檢測(cè)空白管只需檢測(cè)1-2次）

B、新鮮植物葉片或其他綠色組織（含葉綠體）類胡蘿卜素含量測(cè)定步驟：

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)多波長(zhǎng)至470nm、646nm和663nm，分光光度計(jì)用提取液調(diào)零。

2、 樣本檢測(cè)（微量玻璃比色皿檢測(cè)不用測(cè)空白管，用96孔板檢測(cè)空白管只需檢測(cè)1-2次）

注意：若上層浸提液有殘?jiān)?，可吸?/span>1mL上層浸提液置于1.5mL棕色EP管，常溫下4000r/min離心5min，再取上清液檢測(cè)；若使用聚苯乙烯材質(zhì)的96孔板，請(qǐng)?jiān)诩訕雍?/span>5min內(nèi)盡快測(cè)定完成。

三、類胡蘿卜素含量的計(jì)算

A、黃色或其他非綠色組織（不含葉綠體）類胡蘿卜素含量的計(jì)算公式：

1、按微量玻璃比色皿計(jì)算

類胡蘿卜素含量（mg/g 質(zhì)量）=A₄₄₀÷（ε×d）×V 樣總×1000÷W×F=0.04×A₄₄₀×F÷W

V 樣總：提取液總體積，0.01L；1000：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1g=1000mg；ε：類胡蘿卜素經(jīng)驗(yàn)消光系數(shù)，250L/g/cm；d：比色皿光徑，1cm；F：稀釋倍數(shù)；W：樣本質(zhì)量，g。

2、按96孔板計(jì)算

類胡蘿卜素含量（mg/g 質(zhì)量）=ΔA₄₄₀÷（ε×d）×V 樣總×1000÷W×F=0.067×ΔA₄₄₀×F÷W

V 樣總：提取液總體積，0.01L；1000：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1g=1000mg；ε：類胡蘿卜素經(jīng)驗(yàn)消光系數(shù)，250L/g/cm；d：96孔板光徑，0.6cm；F：稀釋倍數(shù)；W：樣本質(zhì)量，g。

B、新鮮植物葉片或其他綠色組織（含葉綠體）類胡蘿卜素含量的計(jì)算公式：

1、按微量玻璃比色皿計(jì)算

C_a（mg/L）=12.21×A₆₆₃-2.81×A₆₄₆

C_b（mg/L）=20.13×A₆₄₆-5.03×A₆₆₃

類胡蘿卜素濃度：C_c（mg/L）=（1000×A₄₇₀-3.27×C_a-104×C_b）÷229=4.367×A₄₇₀-0.014×C_a-0.454×C_b

類胡蘿卜素含量（mg/g 質(zhì)量）=C_c×V提取×F÷W=0.01×C_c×F÷W

V提取：提取液體積，0.01L；F：稀釋倍數(shù)；W：樣本質(zhì)量，g。

2、按96孔板計(jì)算：

C_a（mg/L）=（12.21×ΔA₆₆₃-2.81×ΔA₆₄₆）÷0.6 =20.35×ΔA₆₆₃-4.83×ΔA₆₄₆

C_b（mg/L）=（20.13×ΔA₆₄₆-5.03×ΔA₆₆₃）÷0.6 =33.55×ΔA₆₄₆-8.38×ΔA₆₆₃

類胡蘿卜素濃度：C_c（mg/L）=（1000×ΔA₄₇₀÷0.6-3.27×C_a-104×C_b）÷229=7.278×ΔA₄₇₀-0.014×C_a-0.454×C_b

類胡蘿卜素含量（mg/g 質(zhì)量）=C_c×V提取×F÷W =0.01×C_c×F÷W

V提取：提取液體積，0.01L；F：稀釋倍數(shù)；W：樣本質(zhì)量，g；0.6：光徑比例，0.6cm（96孔板光徑）：1cm（比色皿光徑）。

注意事項(xiàng)：

1. 若不確定組織中有無(wú)葉綠素影響，可取樣本提取液采用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)400-700nm下進(jìn)行掃描，看波長(zhǎng)640-670nm之間有無(wú)波峰，有波峰則為有葉綠素，反之則無(wú)。

2. 若使用聚苯乙烯材質(zhì)的96孔板，請(qǐng)?jiān)诩訕雍?/span>5min內(nèi)盡快測(cè)定完成。

3. 當(dāng)A超過(guò)1時(shí)，建議將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)F。

4. 為了避免色素見(jiàn)光分解，操作時(shí)應(yīng)盡量避光，研磨或勻漿時(shí)應(yīng)盡量縮短時(shí)間。

5. 提取液易揮發(fā)，操作時(shí)做好防護(hù)措施。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g黃色花朵加入1mL蒸餾水、少量試劑一（約10mg），在黑暗或弱光條件下充分研磨，轉(zhuǎn)入10mL離心管，提取液沖洗研缽或勻漿器，用提取液定容至10mL，置于黑暗條件或者包上錫箔紙浸提3h（期間可以顛倒混合2次），按照操作步驟A，用96孔板測(cè)定并計(jì)算ΔA₄₄₀=A₄₄₀測(cè)定管-A₄₄₀空白管=0.202-0.045=0.157，計(jì)算含量得：

類胡蘿卜素含量（mg/g 質(zhì)量）=0.067×A₄₄₀÷W=0.1052 mg/g 質(zhì)量。 

2. 取0.1g綠蘿葉片加入1mL蒸餾水、少量試劑一（約10 mg），在黑暗或弱光條件下充分研磨，轉(zhuǎn)入10 mL離心管，提取液沖洗研缽或勻漿器，用提取液定容至10 mL，置于黑暗條件或者包上錫箔紙浸提3 h（期間可以顛倒混合2次），按照操作步驟B，用96孔板測(cè)定并計(jì)算ΔA₄₇₀=A₄₇₀測(cè)定管-A₄₇₀空白管=0.415-0.043=0.372、ΔA₆₄₆=A₆₄₆測(cè)定管-A₆₄₆空白管=0.189-0.042=0.147、ΔA₆₆₃=A₆₆₃測(cè)定管-A₆₆₃空白管=0.379-0.042=0.337。計(jì)算含量得：

C_a（mg/L）=20.35×0.337-4.83×0.147=6.145 mg/L；

C_b（mg/L）=33.55×0.147-8.38×0.337=2.108 mg/L；

C_c（mg/L）=7.278×ΔA₄₇₀-0.014×C_a-0.454×C_b=1.662 mg/L；計(jì)算含量得：

類胡蘿卜素含量（mg/g 質(zhì)量）=0.01×C_c×F÷W =0.1662 mg/g 質(zhì)量。

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