蔗糖合成酶（分解方向；SS-I）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號: BC4315

規(guī)格: 100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入2.5 mL試劑一充分溶解待用，用不完的試劑建議分裝后，-20℃保存，避免反復(fù)凍融；

2、 標(biāo)準(zhǔn)品：20 mg果糖，臨用前加入1 mL蒸餾水溶解，配成20 mg/mL果糖溶液備用，2-8℃保存一周。

產(chǎn)品說明：

蔗糖合成酶（Sucrose Synthase，SS）是植物糖代謝過程的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)催化蔗糖分解與合成的可逆反應(yīng)，其分解活性可以催化蔗糖水解成UDPG與果糖， 參與淀粉、纖維素和半纖維素的合成等代謝途徑。

分解方向SS-I催化蔗糖和UDP生成果糖與UDPG，果糖與3,5 –二硝基水楊酸反應(yīng)生成在540nm有特征吸收峰的棕紅色物質(zhì)，通過測定540nm處吸光值變化可計算得SS-I活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式低溫離心機(jī)、水浴鍋、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、EP管。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，8000g，離心10min，取上清置于冰上待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至540nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 將20mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為8、6、5、4、3、2、1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

3、 操作表 (在1.5mL離心管中操作) ：

三、SS-I活性計算

1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

以各個標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為x軸，其對應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y=kx+b，將ΔA帶入方程得到x（mg/mL）。

2、 SS-I活性的計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算

酶活定義：每mg蛋白每分鐘分解蔗糖產(chǎn)生1µg果糖為1個酶活力單位。

SS- I酶活（U/mg prot）=x×V提取÷（V提取×Cpr）×10³÷T=33.33x÷Cpr。

（2）按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：每g樣本每分鐘分解蔗糖產(chǎn)生1µg果糖為1個酶活力單位。

SS- I酶活（U/g質(zhì)量）=x×V提取×10³÷W÷T=33.33x÷W。

V提取：提取液體積，1mL；10³：單位換算系數(shù)，1mg=10³µg；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間：30min。

注意事項：

1. 當(dāng)A或ΔA超過1.5時，建議將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測定，計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

2. 95℃水浴時EP管蓋緊，防止水分散失，待冷卻至室溫后（建議每次實驗后冷卻時間保持一致），再進(jìn)行下一步操作，避免液體飛濺燙傷以及影響試驗數(shù)據(jù)。

實驗實例：

1. 取0.1g黑麥草加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清后按照測定步驟操作，用96孔板測得A對照管=0.111，A測定管=0.408，標(biāo)準(zhǔn)曲線y =0.1231x-0.0365，A空白管=0.050，計算ΔA=A測定管-A對照管=0.408-0.111=0.297，x= (0.297+0.0365) ÷0.1231=2.7092，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

SS-I酶活（U/g質(zhì)量）=33.33x÷W=33.33×2.7092÷0.1= 902.976 U/g質(zhì)量。

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