線粒體異檸檬酸脫氫酶（ICDHm）活性檢測試劑盒說明書

微量法

貨號：BC2165

規(guī)格：100T/48S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 提取液二：易揮發(fā)試劑，用完后蓋緊蓋兒后及時放回-20℃保存；

2、 試劑三：臨用前加入0.375 mL蒸餾水，充分溶解待用，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；

3、 標準品：10 mg α-酮戊二酸。臨用前加入684 μL蒸餾水，配成100 μmol/mL標準液，2-8℃保存8周；

4、 工作液的配制：臨用前根據(jù)用量將試劑一、試劑二按1:1比例混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。

產品說明：

線粒體異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，ICDHm），廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中，與線粒體基因表達及線粒體其他的功能有關。異檸檬酸脫氫酶在生物體內有兩種存在形式，以NAD為輔酶的NAD-依賴型異檸檬酸脫氫酶，和以NADP為輔酶的NADP-依賴型異檸檬酸脫氫酶。

異檸檬酸脫氫酶的主要功能，是在體內三羧酸循環(huán)中，催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸，將NAD還原成NADH，通過測定α-酮戊二酸的生成量，可以計算出線粒體異檸檬酸脫氫酶活力高低。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 稱取約0.2 g組織或收集1000萬細胞，加入1mL提取液一和10μL提取液二，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2. 4℃，1000g離心10min。將上清液移至另一離心管中，4℃，11000g離心15min。

3. 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的異檸檬酸脫氫酶（此步可選做，可以判斷線粒體提取效果）。

4. 在沉淀中加入400μL提取液三和4μL提取液二，超聲波破碎（功率300w，超聲5秒，間隔9秒，4min），4℃，10000g離心10min，取上清液用于線粒體異檸檬酸脫氫酶活性測定，并且用于蛋白含量測定。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至505nm，蒸餾水調零。

2、 將標準品用提取液三稀釋至0.6、0.3、0.15、0.075、0.0375、0.01875 μmol/mL標準溶液。

3、 標準溶液稀釋表

實驗中每個標準管需40µL標準溶液。

4、 操作表（在0.6 mLEP管/96孔板中進行如下操作）：

三、ICDHm活性計算

1、標準曲線繪制

以各個標準溶液的濃度為x軸，其對應的ΔA標準為y軸，繪制標準曲線，得到標準方程y=kx+b，將ΔA帶入方程得到x(μmol/mL)。

2、酶活力計算

酶活定義：每mg組織蛋白在反應體系中每分鐘產生1nmol α-酮戊二酸定義為一個酶活性單位。

ICDHm酶活力（U/mg prot）=x×V上清÷（Cpr×V上清）÷T×10³=x÷Cpr×16.67

V上清：加入上清液體積，0.04mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，需自行測定；V反總：反應體系總體積，0.2mL；T：反應時間，1h=60min；10³：單位換算系數(shù)，1μmol =10³nmol。

注意事項：

1、 為保證實驗結果的準確性，需先取1-2個樣做預實驗，如果測定的吸光值過高（高于1），可用提取液三稀釋上清液后再測定。計算結果時注意乘以稀釋倍數(shù)。

2、 推薦使用樣本蛋白濃度計算酶活，若用樣本質量計算，則需加測胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。

3、 測定蛋白濃度時，由于試劑一本身含有蛋白（約1mg/mL），所以測定時需扣除此部分蛋白。

4、 附：使用樣本重量計算公式

A、上清（胞漿）中ICDHm活力計算：

酶活定義：每g組織在反應體系中每分鐘產生1nmol α-酮戊二酸定義為一個酶活性單位。

ICDHm活性（U/g 質量）=x×V樣÷(W×V樣÷V提取)÷T×10³=16.83×x÷W

V提?。杭尤胩崛∫后w積，1.01mL；V樣：加入上清液體積，0.04mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，1h=60min；10³：單位換算系數(shù)，1μmol =10³nmol。

B、沉淀（線粒體）中ICDHm活力計算：

酶活定義：每g組織在反應體系中每分鐘產生1nmol α-酮戊二酸定義為一個酶活性單位。

ICDHm活性（U/g 質量）=x×V樣÷(W×V樣÷V提取)÷T×10³=6.73×x÷W

V提?。撼恋碇貞視r加入提取液體積，0.404mL；V樣：加入上清液體積，0.04mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，1h=60min；10³：單位換算系數(shù)，1μmol =10³nmol。

C、樣本ICDHm總活力計算：

樣本ICDHm總活力即為上清（胞漿）中ICDHm活力與沉淀（線粒體）中ICDHm活力之和。

按樣本質量計算：ICDHm（U/g 質量）=16.83×x÷W+6.73×x÷W

實驗實例：

1、 取0.2g小鼠腎臟加入1.5 mL提取液一和15 μL提取液二，用冰浴勻漿器勻漿。4℃，1000g離心10min。將上清液移至另一離心管中，4℃，11000g離心15min。上清液即胞漿提取物，在沉淀中加入600μL提取液三和6μL提取液二，超聲波破碎，4℃，10000g離心10min，取上清液，分別按操作步驟檢測，用96孔板測得：胞漿ΔA測定=A測定管-A對照管=0.25-0.25=0，線粒體ΔA測定=A測定管-A對照管=0.433-0.279=0.154，帶入標準曲線y=0.5533x+0.0319計算x值，按樣本質量計算酶活得：

胞漿中ICDHm活性（U/g質量）=16.83×x÷W=0 U/g質量

線粒體中ICDHm活性（U/g質量）=6.73×x÷W=7.43 U/g質量

樣本總ICDHm（U/g 質量）=16.83×x÷W+6.73×x÷W=7.43 U/g質量。

2、 取0.3g黑麥草加入1.5mL提取液一和15μL提取液二，用冰浴勻漿器勻漿。4℃，1000g離心10min。將上清液移至另一離心管中，4℃，11000g離心15min。上清液即胞漿提取物，上清液稀釋2倍，在沉淀中加入600μL提取液三和6μL提取液二，超聲波破碎，4℃，10000g離心10min，取上清液稀釋2倍，分別按操作步驟檢測，用96孔板測得：胞漿ΔA測定=A測定管-A對照管=0.377-0.34=0.037，線粒體ΔA測定=A測定管-A對照管=0.711-0.649=0.062，帶入標準曲線y=0.5533x+0.0319計算x值，按樣本質量計算酶活得：

胞漿中ICDHm活性（U/g質量）=16.83×x÷W×2=1.55 U/g質量

線粒體中ICDHm活性（U/g質量）=6.73×x÷W×2=3.66U/g質量

樣本總ICDHm（U/g 質量）=16.83×x÷W×2+9.16×x÷W×2=5.21 U/g質量。

相關發(fā)表文獻：

[1] Xiao Li,Qi Zhao,Jianni Qi,et al. lncRNA Ftx promotes aerobic glycolysis and tumor progression through the

PPARγ pathway in hepatocellular carcinoma. International Journal of Oncology. May 2018;(IF3.571)

參考文獻：

[1] Igamberdiev A U, Gardestr?m P. Regulation of NAD-and NADP-dependent isocitrate dehydrogenases by reduction levels of pyridine nucleotides in mitochondria and cytosol of pea leaves[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 2003, 1606(1-3): 117-125.

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