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產(chǎn)品中心生化檢測(cè)試劑盒-常量法其它系列BC4220-50T/48S4-香豆酸：輔*A連接酶活性檢測(cè)試劑盒 其它
產(chǎn)品型號(hào)：BC4220-50T/48S
更新時(shí)間：2024-04-15
廠商性質(zhì)：生產(chǎn)廠家
訪 問 量 ：851
010-50973130
產(chǎn)品分類
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4-香豆酸：輔*A連接酶（4CL）活性檢測(cè)試劑盒說明書
紫外分光光度法
貨號(hào): BC4220
規(guī)格: 50T/48S
產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。
| 試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
| 提取液 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 試劑一 | 液體30 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 試劑二 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
| 試劑三 | 液體6 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
| 試劑四 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
| 試劑五 | 粉劑×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
提取液：內(nèi)含不溶物，使用前搖勻；
試劑二：臨用前加入6 mL蒸餾水溶解，可以分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；
試劑四：臨用前用6 mL蒸餾水溶解備用，可以分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；
試劑五：加入1 mL乙醇溶解，臨用前用蒸餾水稀釋40倍后備用，現(xiàn)用現(xiàn)配；
工作液的配制：按體積比將試劑二：試劑三：試劑四：試劑五=1:1:1:1的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。
產(chǎn)品說明：
4-香豆酸：輔*A連接酶（4-coumarate:CoA ligase，4CL）是木質(zhì)素生物合成的關(guān)鍵酶之一，主要催化肉桂酸及其羥基或者甲氧基衍生物生成相應(yīng)的輔*A酯，這些中間產(chǎn)物隨后進(jìn)入苯丙類衍生物支路合成途徑。該酶主要存在于高等植物、酵母和菌類中，研究該酶可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機(jī)理，為減少水果石細(xì)胞含量而提高其品質(zhì)提供依據(jù)。
4CL催化4-香豆酸和CoA生成4-香豆酸CoA，其在333nm下測(cè)有特征吸收峰，測(cè)定4-香豆酸CoA的生成速率，即可反映4CL活性。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)、低溫臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、EP管、冰和蒸餾水。
操作步驟：
樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）
細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
二、測(cè)定步驟
紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至333nm，蒸餾水調(diào)零。
操作表（在1.5mLEP管中進(jìn)行下列操作）：
| 測(cè)定管 | 空白管 | |
| 樣本（µL） | 100 | - |
| 蒸餾水（µL） | - | 100 |
| 工作液（µL） | 400 | 400 |
| 試劑一（µL） | 500 | 500 |
| 充分混勻后測(cè)定333nm下的10s初始值A(chǔ)1，37℃反應(yīng)1h后再次測(cè)定1h 10s吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA測(cè)定管=A2測(cè)定管-A1測(cè)定管，ΔA空白管= A2空白管-A1空白管，ΔA=ΔA測(cè)定管-ΔA空白 | ||
三、4CL活性計(jì)算
按樣本蛋白濃度計(jì)算：
單位定義：每mg組織蛋白每小時(shí)生成1nmol 4-香豆酸輔*A定義為一個(gè)酶活力單位。
4CL（U/mg prot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=476.19×ΔA÷Cpr
按樣本質(zhì)量計(jì)算：
單位定義：每g組織每小時(shí)生成1nmol 4-香豆酸輔*A定義為一個(gè)酶活力單位。
4CL（U/g 質(zhì)量）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T=476.19×ΔA÷W
按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：
單位定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)生成1nmol 4-香豆酸輔*A定義為一個(gè)酶活力單位。
4CL（U/104 cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.9124×ΔA
V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10-3L；ε：4-香豆酸輔*摩爾消光系數(shù)，2.1×104L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.1mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，1h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬；109：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=109nmol。
注意事項(xiàng)：
若ΔA大于0.5，將樣本用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。
建議一次測(cè)定不要測(cè)定過多樣本以免耽誤過多的酶促反應(yīng)時(shí)間。
空白管為檢測(cè)各試劑組分質(zhì)量的檢測(cè)孔，正常情況下，變化不超過0.01。
實(shí)驗(yàn)實(shí)例：
取0.1g芥菜加1mL提取液進(jìn)行樣本處理，取上清后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得ΔA測(cè)定管=A2測(cè)定管-A1測(cè)定管=0.784-0.655=0.129，ΔA空白管= A2空白管-A1空白管=0，ΔA=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管=0.129，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：4CL（U/g 質(zhì)量）=476.19×ΔA÷W=476.19×0.129÷0.1=614.29 U/g 質(zhì)量。
相關(guān)系列產(chǎn)品：
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4-香豆酸：輔*A連接酶活性檢測(cè)試劑盒 其它 4-香豆酸：輔*A連接酶活性檢測(cè)試劑盒 其它
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