山*醇脫氫酶（SDH）活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號：BC2535
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：取3.4 mL試劑五加入1瓶試劑一粉劑中溶解，再加入一支試劑四，現(xiàn)用現(xiàn)配，24 h變質(zhì)；

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入1.4 mL蒸餾水，即10 μmol/mL NADH標(biāo)準(zhǔn)品。-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說明：
SDH（EC 1.1.1.14）催化山*醇脫氫生成果糖，是調(diào)控生物體內(nèi)山*醇含量的關(guān)健酶之一。SDH催化山*醇脫氫生成果糖，同時還原NAD⁺生成NADH，生成的NADH能將電子傳遞給NBT生成紫色的甲臜，根據(jù)這一原理可以計算SDH活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、超聲破碎儀，可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件
一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴功率200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000×g 4℃離心10 min，取上清，置冰上待測。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1 g組織，加入1 mL提取液），進行冰浴勻漿。8000 ×g 4℃離心10 min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣本：直接檢測。
二、測定步驟
1、可見分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長至570 nm，可見分光光度計蒸餾水調(diào)零。
2、標(biāo)準(zhǔn)管的測定：將10 μmol/mL NADH標(biāo)準(zhǔn)品用水稀釋至1.5、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3 μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液
(1) 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表

實驗中每個標(biāo)準(zhǔn)管需20µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。
（2）標(biāo)準(zhǔn)品測定表

3、樣本的測定：

將上述試劑按順序加微量玻璃比色皿/96孔板中，加試劑一的同時開始計時，記錄 10 秒時的初始吸光度A1，比色后迅速將比色皿連同反應(yīng)液一起放入37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)3分鐘；迅速取出比色皿并擦干，570 nm下比色，記錄3分10秒時的吸光度A2，計算ΔA測定=A2-A1。（整個實驗過程要避光）

注意事項：
1.ΔA大于0.7時，建議將樣本用提取液稀釋后測量，計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
2.測定過程中樣本和工作液在冰上放置，以免變性和失活。
3.比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。
參考文獻：
Aguayo M F, Ampuero D, Mandujano P, et al. Sorbitol dehydrogenase is a cytosolic protein required for sorbitol metabolism in Arabidopsis thaliana[J]. Plant science, 2013, 205: 63-75.
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