丁酰膽*酯酶抑制劑活性檢測(cè)試劑盒說明書

微量法

貨號(hào)：BC5985

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前加入1.2mL蒸餾水，充分溶解，用不完的試劑-20℃分裝后可保存4周，避免反復(fù)凍融該試劑為凍干試劑，可能存在不同瓶間肉眼觀察試劑量相差較大甚至量很少的現(xiàn)象，此現(xiàn)象不影響使用，實(shí)際質(zhì)量相同。

2. 試劑四：臨用前加入6mL試劑二，充分溶解，用不完的試劑-20℃可分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

3. 試劑五：10mmol/L利凡斯的明溶液。臨用前取15μL 10mmol/L利凡斯的明溶液，加入985μL蒸餾水，配制成0.15mmol/L利凡斯的明溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配（此試劑用于陽性管實(shí)驗(yàn)，選做）。

產(chǎn)品說明：

丁酰膽*酯酶（Butyrylcholinesterase，BchE，EC3.1.1.8），又稱血漿*堿酯酶，假性膽*酯酶，是一種絲*酸水解酶，由肝臟合成后進(jìn)入血液，幾乎存在于所有動(dòng)物組織中。與乙酰膽*酯酶（AchE）相比，BchE能夠有效水解較大的膽*酯，如丁酰膽*和苯甲酰膽*，而且可以清除有機(jī)磷類農(nóng)藥、氨基甲酸酯類農(nóng)藥等神經(jīng)毒劑的毒害作用。有研究表明，BchE可作為阿爾茨海默病治療的重要靶點(diǎn)，BchE抑制劑被用于改善阿爾茨海默病患者記憶力減退、認(rèn)知功能障礙等病征。

BchE催化丁酰膽*水解生成*堿，膽*與二硫代硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巰基-硝基苯甲酸（TNB），BchE抑制劑通過抑制BchE活性，減少丁酰膽*的水解。TNB在412nm處有吸收峰，可通過測(cè)定412nm處吸光度的變化，計(jì)算BchE抑制劑活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、天平、烘箱、粉碎儀/研缽/勻漿器、30-50目篩、超聲清洗儀、離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織樣本：將樣本烘干至恒重，粉碎，過30-50目篩之后，稱取約0.1g，加入1mL提取液，用超聲提取法進(jìn)行提取，超聲功率300W，60℃，提取30min。12000rpm，25℃，離心10min，取上清，用提取液定容至1mL，待測(cè)。

2. 粉劑樣本：稱取適量樣本，加入適量提取液，配制成適宜濃度的溶液待測(cè)。

注：若粉劑樣本不溶于提取液，可先用合適的溶劑溶解，配制成100×或者更大濃度的溶液，再用提取液稀釋至1×濃度。

二、 測(cè)定步驟

1．可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至412nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2．操作表：（在微量玻璃比色皿/96孔板中加入下列試劑）

三、丁酰膽*酯酶抑制劑活性計(jì)算

1. 抑制率計(jì)算

丁酰膽*酯酶抑制劑

抑制率（%）=（ΔA_空白-ΔA_測(cè)定）÷ΔA_空白×100%。

2. IC₅₀計(jì)算

IC₅₀，即抑制劑半抑制濃度。對(duì)于確定對(duì)BchE有抑制作用的樣本，可配制成適當(dāng)?shù)臐舛忍荻?，分別以樣本濃度為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)作抑制曲線，以此計(jì)算得到抑制率為50%時(shí)的樣本濃度，即IC₅₀。

注意事項(xiàng)：

1. 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，請(qǐng)嚴(yán)格控制反應(yīng)時(shí)間和操作時(shí)間。

2. 樣本吸光度大于1.6或ΔA_測(cè)定接近ΔA_空白時(shí)，建議在樣本處理步驟增加組織樣本比例或?qū)⒎蹌颖九渲瞥筛邼舛鹊娜芤涸龠M(jìn)行測(cè)定。當(dāng)ΔA_測(cè)定小于0.004時(shí)，可以將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。

3. 若用于比較不同試劑、提取物、藥物或組織對(duì)BchE的抑制程度，必須將試劑、提取物、藥物或組織勻漿配制成相同濃度進(jìn)行比較。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1005g柚果皮樣本（烘干），加入1mL提取液進(jìn)行超聲提取，離心后取上清，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算：ΔA_空白=（A’_空白1-A_空白1）-（A’_空白2-A_空白2）=（1.129-0.133）-（0.141-0.120）=0.975，ΔA_測(cè)定=（A’_測(cè)定-A_測(cè)定）-（A’_空白2-A_空白2）=（0.878-0.337）-（0.141-0.120）=0.520，計(jì)算抑制率得：

BchE抑制劑抑制率（%）=（0.975-0.520）÷0.975×100%=46.667%。

2. 取0.1014g柿果皮樣本（烘干），加入1mL提取液進(jìn)行超聲提取，離心后取上清，稀釋16倍后按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算：ΔA_空白=（A’_空白1-A_空白1）-（A’_空白2-A_空白2）=（1.129-0.133）-（0.141-0.120）=0.975，ΔA_測(cè)定=（A’_測(cè)定-A_測(cè)定）-（A’_空白2-A_空白2）=（0.581-0.127）-（0.141-0.120）=0.433，計(jì)算抑制率得：

BchE抑制劑抑制率（%）=（0.975-0.433）÷0.975×100%=55.590%。

3. 取10μL 0.15mmol/L利凡斯的明溶液，按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得計(jì)算：ΔA_空白=（A’_空白1-A_空白1）-（A’_空白2-A_空白2）=（1.129-0.133）-（0.141-0.120）=0.975，ΔA_測(cè)定=（A’_測(cè)定-A_測(cè)定）-（A’_空白2-A_空白2）=（0.631-0.126）-（0.141-0.120）=0.484，計(jì)算抑制率得：

BchE抑制劑抑制率（%）=（0.975-0.484）÷0.975×100%=50.359%。

參考文獻(xiàn)：

[1] Ellman GL, Courtney KD, Andres V Jr. et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity [J]. Biochemical Pharmacology, 1961, 7(2): 88-95.

[2] Noor Atatreh, Sara Al Rawashdah, Shaikha S Al Neyadi. et al. Discovery of new butyrylcholinesterase inhibitors via structure-based virtual screening [J]. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 2019, 34(1): 1373-1379.

[3] Li Q, Chen Y, Xing S. et al. Highly Potent and Selective Butyrylcholinesterase Inhibitors for Cognitive Improvement and Neuroprotection [J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2021, 64(10): 6856-6876.

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