western blot的作用

免疫印跡是一個(gè)用于蛋白質(zhì)分析的常規(guī)技術(shù)，在電場(chǎng)的作用下將電泳分離的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移一種固相支持物，然后利用抗原—抗體的特異性反應(yīng)，從蛋白混合物中檢測(cè)出目標(biāo)蛋白，從而定量或定性地確定正常或?qū)嶒?yàn)條件下細(xì)胞或組織中目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。Western blot還可用于蛋白—蛋白、蛋白—DNA和蛋白—RNA相互作用的后續(xù)分析，作為一種廉價(jià)、便捷、可靠的研究工具，將與質(zhì)譜和蛋白質(zhì)芯片等技術(shù)一起在蛋白質(zhì)組時(shí)代發(fā)揮重要作用。

Western bloting的注意事項(xiàng)

1、為了讓實(shí)驗(yàn)更加嚴(yán)謹(jǐn)有說(shuō)服力都要設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，對(duì)照分為：陽(yáng)性對(duì)照（好有標(biāo)準(zhǔn)品（比如β-actin，GAPDH）或陽(yáng)性血清）；陰性對(duì)照（測(cè)血時(shí)用相應(yīng)小鼠未免疫血清（即正常血）；空白對(duì)照（不加一抗，用PBS代替）；無(wú)關(guān)對(duì)照（用無(wú)關(guān)抗體）

2、一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說(shuō)明書(shū)選擇適當(dāng)?shù)谋壤?，一抗二抗的選擇直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及背景

3、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)所釆用的抗原批次要一樣，盡量的避免人為的帶來(lái)個(gè)體差異。特別在做裂解液時(shí)更要注意所釆用的操作條件，盡可能的排除可變因素給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)不確定性。

4、凝膠的質(zhì)量直接影響以后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，要特別注意幾點(diǎn)：凝膠要均一沒(méi)有氣泡；積層膠與分離膠界面要水平；AP和TEMED的量不能過(guò)多，太多會(huì)導(dǎo)致膠易脆裂；拔梳子時(shí)要快，盡量保證點(diǎn)樣孔平整。

5、電泳、轉(zhuǎn)膜時(shí)特別要注意正負(fù)極，電壓電流都不能過(guò)高；轉(zhuǎn)膜時(shí)“三明治”的疊放次序不錯(cuò)，同時(shí)要防止產(chǎn)生氣泡；盡量讓電轉(zhuǎn)溫度保持在10度以下，冰浴為宜。

6、封閉時(shí)一般在室溫下2h就夠了，但是要注意如果是生物素標(biāo)記的二抗就不宜用牛奶，因?yàn)榕Ｄ讨泻猩锼?，用BSA效果更好。

7、加一抗二抗要嚴(yán)格保證反應(yīng)時(shí)間，洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背景；