細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也叫細(xì)胞克隆技術(shù)，在生物學(xué)中的正規(guī)名詞為細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)?，F(xiàn)代生物技術(shù)一般認(rèn)為包括基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)、酶工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)，而這些技術(shù)的發(fā)展幾乎都與細(xì)胞培養(yǎng)有密切關(guān)系，特別是在醫(yī)藥領(lǐng)域的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)更具有特殊的作用和價(jià)值。以下來(lái)具體講一下細(xì)胞培養(yǎng)的步驟。

    細(xì)胞培養(yǎng)的步驟

    一、細(xì)胞復(fù)蘇：

    1. 將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水浴鍋中回溫，回溫后噴以75%酒精并擦拭之，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。如配置：50mL*培養(yǎng)基(含10%FBS，1%青鏈霉素雙抗)44.5mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基 + 5mL FBS + 0.5mL青鏈霉素雙抗。

    2. 戴防護(hù)手套后，自液氮罐中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，立即放入37℃水槽中快速解凍（避免冰晶重新結(jié)晶而造成細(xì)胞死亡），輕搖冷凍管使其在2分鐘內(nèi)全部融化，以75%酒精擦拭保存管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。

    3. 將解凍的1mL細(xì)胞懸液緩緩加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，再向瓶中加入10mL*培養(yǎng)基(稀釋比例為1:10)，混合均勻，放入37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取0.1ml解凍細(xì)胞懸液作存活測(cè)試。(Sf9細(xì)胞在27℃生長(zhǎng)，可不需CO2)

    4. 一般而言，細(xì)胞大都不需立即去除冷凍保護(hù)劑(例如DMSO)。若要立即去除，則將解凍的細(xì)胞懸液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi)，離心1300rpm，5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養(yǎng)基，混合均勻，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。

    二、傳代培養(yǎng)：

    1. 37℃恒溫培養(yǎng)約48小時(shí)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80-90%后，從培養(yǎng)箱取出75cm2培養(yǎng)瓶，倒掉培養(yǎng)基。加入5mLPBS緩沖液吹打以洗去殘留血清，倒掉緩沖液。

    2. 沿壁（無(wú)細(xì)胞的一面）緩緩加入1mL胰酶溶液消化細(xì)胞約1min，輕輕搖晃，倒掉殘余胰酶，將培養(yǎng)瓶置于恒溫箱中約1min，拿出培養(yǎng)瓶輕輕拍打一下細(xì)胞貼壁的一面。

    注意：佳消化溫度是37℃，加液后用移液管反復(fù)吹打分散細(xì)胞。

    3. 向瓶中加入5mL*培養(yǎng)基，反復(fù)吹打均勻2min，從中取出20μl0.5ml小離心管中，向管中加入80μl臺(tái)盼藍(lán)溶液，混勻，從混合液中取出10μl蓋好蓋玻片的計(jì)數(shù)板上，計(jì)算細(xì)胞密度及活率。

    4. 將5mL細(xì)胞懸液全部吸出，分別接種1mL懸液到原培養(yǎng)瓶和另一新的培養(yǎng)瓶中，其余舍棄。再向兩瓶中各加入10mL*培養(yǎng)基，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（細(xì)胞傳代時(shí)按1：5或更大比例稀釋）

    三、細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測(cè)試：

    1. 取10μl混合液自血球計(jì)數(shù)盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞則為藍(lán)色。

    2. 計(jì)數(shù)四個(gè)大方格的細(xì)胞總數(shù)。計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，適濃度為5～10×105細(xì)胞/ml。高濃度細(xì)胞懸液，可取出部分稀釋后計(jì)數(shù)。

    3. 每一大格的體積為0.1cm×0.1cm×0.01cm= 10-4ml。若細(xì)胞位于線上，只計(jì)左線與上線的細(xì)胞。

    注：細(xì)胞密度= 四大格細(xì)胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×104/4= 細(xì)胞數(shù)/ml；

    細(xì)胞活率= 活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×100%。                         

    四、細(xì)胞凍存：

    1. 冷凍前確保細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期，傳代后的5mL細(xì)胞懸液取出1mL接種到培養(yǎng)瓶繼續(xù)傳代。另取一無(wú)菌離心管，將剩余4mL細(xì)胞懸液置于其中，離心1000rpm，5min（轉(zhuǎn)速勿超過(guò)1500rpm）。

    2. 離心后倒掉上層清液，收集下層細(xì)胞沉淀。向離心管中加入900ul*培養(yǎng)基，用槍頭反復(fù)吹打重懸起細(xì)胞。取少量細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。一般細(xì)胞濃度為2~5×106cells/ml較適宜。

    3. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入1.5mL無(wú)菌凍存管中，再加入100ul試劑級(jí)DMSO，混勻，制成細(xì)胞凍存懸液（DMSO后濃度為10％）。嚴(yán)密封口后，注明細(xì)胞名稱、代數(shù)、日期，然后進(jìn)行凍存。

    注意：對(duì)Sf9細(xì)胞而言，凍存比例為：95%培養(yǎng)液+5%DMSO。

    5. 傳統(tǒng)方法：冷存管置于4℃10分鐘→-20℃30分鐘→-80℃16~18小時(shí)（隔夜）→液氮罐長(zhǎng)期儲(chǔ)存。（-20℃勿超過(guò)1小時(shí)，防止胞內(nèi)冰晶過(guò)大造成細(xì)胞死亡）