1.通過(guò)代謝組全基因組關(guān)聯(lián)研究(mGWAS)鑒定出兩個(gè)酚酰胺生物合成基因簇
作者為研究番茄馴化中酚酰胺含量（及其遺傳基礎(chǔ)），對(duì)401個(gè)番茄品種進(jìn)行代謝分析。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)酚酰胺豐度下降（圖1A）。mGWAS揭示第11號(hào)染色體與diCou-Put和diCaf-Put相關(guān)，第7號(hào)染色體與FerCaf-Spd相關(guān)（圖1B、C）。第11號(hào)染色體上的SNP(sf1154946315)附近鑒定出8個(gè)控制酚酰胺含量的基因，包括?；D(zhuǎn)移酶、UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶等（圖1B）。第7號(hào)染色體上圍繞顯著SNP(sf0703267875)發(fā)現(xiàn)4個(gè)基因，涉及?；D(zhuǎn)移酶、4-香豆酸CoA連接酶及MATE基因（圖1C）。這兩組共定位的基因可能代表番茄中調(diào)節(jié)酚酰胺的生物合成基因簇，分別稱為BGC11和BGC7。
為鑒定BGC11和BGC7中5個(gè)?；D(zhuǎn)移酶、2個(gè)4-香豆酸輔酶A連接酶和2個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶的生物學(xué)功能，克隆了這些候選基因的編碼DNA序列(CDSs)。SIAT1.1、SIAT1.2和SIAT1.3表現(xiàn)出以腐胺為酰基受體和香豆酰輔酶A為酰基供體的?；D(zhuǎn)移酶活性（圖1D）。其中SIAT1.2可催化雙酰基化（圖1D）。SIDH29、SICV86分別催化?；鶃喚飞蒀af-Spd、diCaf-Spd（圖1E）。在煙葉中，SI4CL1.1、1.2將香豆酸、咖啡酸分別轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的輔酶A（圖1F、G）。SIUGT93U2、93U3將Fer-Put轉(zhuǎn)化為(Fer-O-Hex)-Put（圖1H）。此外，SIC3H被證實(shí)能夠生成咖啡酸（圖1I）。
最后，進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析以驗(yàn)證SIDTX29是否作為番茄中的酚酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)體。在過(guò)表達(dá)SIDTX29的轉(zhuǎn)基因番茄植株(SIDTX29-OE)中觀察到了轉(zhuǎn)運(yùn)活性（圖1J）。與野生型(WT)植物相比，SIDTX29-OE株系對(duì)Spd的敏感性更強(qiáng)，并且使用8D標(biāo)記的Spd和液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)證明其對(duì)Spd吸收活性也更高（圖1K）。以上結(jié)果表明，BGC11和BGC7是兩個(gè)新發(fā)現(xiàn)的酚酰胺生物合成基因簇。
圖1|酚酰胺生物合成基因簇BGC11
和BGC7的鑒定
2. BGC11和BGC7對(duì)番茄中酚酰胺多樣性的貢獻(xiàn)
作者為探究BGC11和BGC7核心酶在番茄中的功能，構(gòu)建了過(guò)表達(dá)SIAT1.1、SIAT1.2、SIAT1.3、SIDH29和SICV86的轉(zhuǎn)基因番茄株系。代謝物分析顯示，SIAT1.1/1.3-OE株系中單酰基化Put衍生的酚酰胺增加（圖2A-B），而二酰基化的Put衍生酚酰胺在SIAT1.2-OE株系中過(guò)度積累（圖2C）。隨后研究發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas9生成的SIAT1.2突變株系(SIat1.2-CR)中二?；吁０窚p少，尤其diCou-Put減少近3倍（圖2D），表明BGC11增強(qiáng)了Put衍生酚酰胺多樣性。類似地，SIDH29-OE株系中單?；疭pd衍生酚酰胺增加（圖2E），而SICV86-OE株系中二酰基化Spd衍生酚酰胺積累更多（圖2F），再次表明了Spd衍生酚酰胺的多樣化。
為研究轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SIDTX29如何影響酚酰胺代謝，進(jìn)一步使用LC-MS測(cè)定了酚酰胺積累。結(jié)果表明SIDTX29-OE品系中Caf-Spd、Fer-Spd和diCaf-Spd積累明顯增加（圖2G）。BGC7的四個(gè)基因共表達(dá)使煙葉中的Caf-Spd含量增加了35.4倍（圖2H）。單獨(dú)或共表達(dá)也導(dǎo)致Caf-Spd的積累顯著增加（圖2H）。研究表明BGC11與Put衍生的酚酰胺，BGC7與Spd衍生酚酰胺的生物合成與修飾、運(yùn)輸?shù)年P(guān)系（圖2I）。以上發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了BGC11和BGC7這兩個(gè)基因簇在番茄酚酰胺多樣性中發(fā)揮的關(guān)鍵作用。
圖2|番茄中酚酰胺生物合成、修飾和
轉(zhuǎn)運(yùn)的代謝網(wǎng)絡(luò)
3. SlMYB13直接正向調(diào)控BGC11和BGC7中的基因表達(dá)，以促進(jìn)酚酰胺的積累
接下來(lái)，作者通過(guò)分析兩個(gè)BGC基因簇的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)它們主要在根、花、葉、莖、果實(shí)中高度表達(dá)。熒光定量PCR 驗(yàn)證了二者的同步表達(dá)（圖3A）。共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析表明SIMYB13與BGC7和BGC11在花、根中的表達(dá)模式的相關(guān)性較強(qiáng)。此外，SIMYB13和基因簇均因干旱脅迫和脫落酸(ABA)處理而上調(diào)，表明存在脅迫響應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制（圖3B和3C）。
為了描述SIMYB13與BGC11和BGC7的12個(gè)基因之間的相互調(diào)控作用，進(jìn)一步通過(guò)酵母單雜交試驗(yàn)證實(shí)了SIMYB13與基因啟動(dòng)子的直接相互作用（圖3D）。SIMYB13-OE系顯示BGC7和BGC11基因表達(dá)增加，Put衍生和Spd衍生的酚酰胺水平更高（圖3E）。相反，SImyb13-CR系顯示12個(gè)基因的表達(dá)減弱，且酚酰胺含量減少（圖3F）。綜上所述，SIMYB13正向調(diào)控番茄中的BGC11和BGC7，突出了其在促進(jìn)酚酰胺積累中的作用。
圖3|12個(gè)酚酰胺生物合成
基因的共同調(diào)控
4. BGC11、BGC7和SIMYB13通過(guò)促進(jìn)番茄中酚酰胺的積累提高耐旱性
在進(jìn)一步的研究中，作者使用表達(dá)SIMYB13和核心BGC基因的轉(zhuǎn)基因品系開展干旱脅迫實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明SIAT1.1-OE、SIAT1.2-OE、SICV86-OE和SIMYB13-OE品系比WT植株更耐旱，其中SIAT1.2-OE特別耐旱（圖4A和4B）；相比之下，SImyb13-CR系比WT植株對(duì)干旱脅迫更敏感（圖4C）。在水分充足或干旱脅迫條件下，SIat1.2-CR系和WT植株之間沒(méi)有顯著差異（圖4D-4F）。SIMYB13-OE、SIAT1.1-OE、SIAT1.2-OE和SICV86-OE系在干旱條件下比WT植株表現(xiàn)出更高的存活率和更高的相對(duì)含水量，而SImyb13-CR系則表現(xiàn)出相反的模式（圖4E和4F）。超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定和丙二醛(MDA)積累試驗(yàn)表明，與WT植物相比，SIAT1.2-OE和SIMYB13-OE植物的活性氧(ROS)清除能力增強(qiáng)，MDA積累減少（補(bǔ)充圖）。這些結(jié)果表明BGC11、BGC7和SIMYB13可以增強(qiáng)番茄的耐旱性。
作者通過(guò)分析轉(zhuǎn)基因植株在干旱脅迫下的ABA水平發(fā)現(xiàn)，SIMYB13-OE、SIAT1.1-OE、SIAT1.2-OE和SICV86-OE品系的ABA積累高于WT，而SImyb13CR品系中ABA積累較少（圖4G）。通過(guò)RT-qPCR進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，干旱脅迫后，ABA合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因在過(guò)表達(dá)品系中表達(dá)增加，而在SImyb13-CR中減少（圖4H-I）。SIat1.2CR與WT在ABA含量或基因表達(dá)上無(wú)顯著差異。因此，BGC11、BGC7和SIMYB13可以影響ABA含量。
進(jìn)一步分析結(jié)果表明，干旱條件下SIAT1.1-OE、SIAT1.2-OE等植株中酚酰胺（如Fer-Put等）積累高于WT，而SImyb13-CR較低（圖4J）。外源Fer-Put處理WT植物后，ABA含量顯著升高（圖4K），且相關(guān)基因表達(dá)也增加（圖4L-M）。這表明酚酰胺積累（受BGC11、BGC7和SIMYB13調(diào)控）通過(guò)增強(qiáng)ROS清除能力和增加ABA來(lái)增強(qiáng)番茄耐旱性。
圖4|BGC11、BGC7和SIMYB13在
番茄耐旱性中的作用
補(bǔ)充圖|WT、SIAT1.2-OE和
SIMYB13-OE轉(zhuǎn)基因植株中ROS
積累和ABA相關(guān)基因表達(dá)比較
5. 番茄馴化和改良過(guò)程中BGC11、BGC7和SIMYB13的自然變異
接下來(lái)，為探究BGC11、BGC7和SIMYB13的進(jìn)化歷史，作者比較了三個(gè)番茄亞組之間的核苷酸多樣性(π)。在變異分析中，作者在SIMYB13的CDS區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與Fer-Put、diCou-Put和diCaf-Spd相關(guān)的非同義突變?；谠撟儺悾逊N群被分為兩個(gè)單倍型組，即SIMYB13-THapA和SIMYB13-GHapB。SIMYB13-GHapB的Fer-Put(P = 2.36×10-9)，diCou-Put（P = 3.15×10-5）和diCaf-Spd（P = 2.15×10-9）濃度顯著高于SIMYB13-THapA，且在番茄馴化和改良過(guò)程中頻率逐漸降低（圖5A）。
同時(shí)，作者在煙葉中瞬時(shí)表達(dá)了SIMYB13-THapA和SIMYB13-GHapB，并發(fā)現(xiàn)SIMYB13-GHapB中酚酰胺的積累量更大（圖5B）。此外，表達(dá)這兩種單倍型的SIMYB13-OE株系比WT植株表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐旱性；特別是SIMYB13-GHapB，在干旱條件下保持了更強(qiáng)的ROS清除能力以及更低的MDA水平（圖5C和5D）。以上結(jié)果表明，SIMYB13-GHapB可以調(diào)節(jié)酚酰胺的積累，并在番茄馴化和改良過(guò)程中經(jīng)歷了負(fù)向選擇。
基于上述結(jié)果，作者將六個(gè)基因單倍型組合為HapA、HapB和HapC三組。結(jié)果顯示，HapB品種的酚酰胺積累量遠(yuǎn)高于HapA（圖5F、G），耐旱性也更強(qiáng)（圖5H）。經(jīng)RT-qPCR和代謝組學(xué)分析證實(shí)，HapB中這些基因的轉(zhuǎn)錄本上調(diào)，酚酰胺積累量增加（圖5I）。以上發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了HapB單倍型與酚酰胺含量增加的關(guān)聯(lián)，HapB的消耗可能是導(dǎo)致番茄耐旱性降低的因素之一。
圖5|番茄馴化過(guò)程中對(duì)BGC11、BGC7
和SIMYB13的逐步篩選
6. BGC11和BGC7在植物中的進(jìn)化史
為了進(jìn)一步探索BGC11和BGC7基因的進(jìn)化歷史，作者對(duì)30個(gè)具有進(jìn)化代表性的物種進(jìn)行了比較基因組分析。分析表明，發(fā)現(xiàn)CPA基因在藻類中存在且保守，而4CL、C3H和UGT基因源于陸生植物祖先。BGC11和BGC7核心基因僅存在于陸生植物中。BGC11和BGC7基因聚集在茄科植物中，馬鈴薯和番茄基因共線性較強(qiáng)。這些發(fā)現(xiàn)突出了酚酰胺BGCs在植物適應(yīng)陸地環(huán)境及茄科植物保護(hù)中的重要性（圖6）。
考慮到物種的系統(tǒng)發(fā)育和全基因組復(fù)制的歷史，作者提出了一個(gè)進(jìn)化模型來(lái)解釋BGC11和BGC7基因簇的起源。1910萬(wàn)年前基因組重排影響B(tài)GC11，620萬(wàn)年前串聯(lián)重復(fù)影響B(tài)GC7。這些發(fā)現(xiàn)表明，基因簇的形成和多樣化依賴于結(jié)構(gòu)變異和基因得失。在番茄馴化中，BGC11、BGC7和SIMYB13的HapB受負(fù)向選擇，導(dǎo)致酚酰胺含量下降，影響耐旱性（圖7）。
圖7|兩個(gè)馴化相關(guān)基因簇
（BGC11和BGC7）和SIMYB13
調(diào)節(jié)番茄耐旱性的示意圖
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