IHC是一項具有挑戰(zhàn)性的應(yīng)用技術(shù)，應(yīng)用過程中常出現(xiàn)各種問題，例如檢測結(jié)果陰性，非特異性染色，染色強度不夠，著色不均，脫片，干片等。因此索萊寶為大家總結(jié)了一些IHC常見問題及處理方法，來幫助您改進IHC檢測，減少您的實驗優(yōu)化過程，快速達到預期結(jié)果。

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a）甲醛：甲醛是保留組織和細胞內(nèi)蛋白靶點的常用固定劑，是大多數(shù)IHC/ICC應(yīng)用的良好選擇，但并不是一種通用的固定劑。醛的過度固定會修飾氨基酸（屬于表位中的一部分），并阻斷抗體與之結(jié)合。然而大部分情況下，利用抗原修復技術(shù)可暴露表位，以還原抗體結(jié)合。研究表明甲醛會誘導磷酸化依賴表位的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)位，從細胞膜轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)。在這種情況下，冰預冷的無水甲醇或無水乙醇是適當?shù)奶娲?/p>

b）醇類：常用于細胞和組織固定的醇類是甲醇和乙醇。通常認為醇類不像甲醛固定劑那樣保留組織形態(tài)，不像甲醛那樣滲透，主要用于固定冰凍組織切片和細胞。在醇類固定之后不推薦進行抗原修復。

c）丙酮：丙酮是一種強的脫水劑，能引起組織蛋白的不可逆沉淀。它常用于未固定、快速冷凍組織的切片。

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a）培養(yǎng)細胞：培養(yǎng)細胞的固定時間與組織相比較短，且固定液的濃度更低。例如，用2%甲醛溶液在室溫下固定20min，足以保留細胞形態(tài)和抗原性。

培養(yǎng)細胞的固定通常只是去除培養(yǎng)基，并加入固定液即可。不過，去除培養(yǎng)基后表面張力的變化可能損害某些細胞類型。如果是這種情況，固定劑可直接加入培養(yǎng)基中。例如，加入與培養(yǎng)基相同體積的4%甲醛，將得到2%甲醛溶液，它足以預固定細胞。2min后，預固定培養(yǎng)基應(yīng)當替換成新鮮的2%固定劑。預固定步驟讓細胞更加堅硬，這樣它們就能夠承受表面張力改變所引起的任何可能的有害影響。

b）組織：對于小組織來說，浸入固定溶液通常能獲得足夠的固定?？蓪⒔馄实慕M織浸潤在固定劑中，但是如果將固定溶液經(jīng)由內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)（無論是通過心臟或通過腹主動脈）灌注，則往往能獲得更快速、更均勻的固定。在研究小動物的完整組織時，灌注固定是保留抗原的方法，包括用固定液來取代動物的全身血液。4%甲醛是組織灌注和浸潤固定的常用溶液。

為了在浸潤固定過程中加強固定劑的滲透，建議組織厚度不超過5mm。對于完整的固定，固定劑的體積應(yīng)當是組織體積的50-100倍。固定通常在室溫下進行4-24小時。由于固定不足或固定過度可能降低或破壞組織的免疫反應(yīng)性，因此優(yōu)化條件很重要。

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由于組織在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而掩蓋抗原決定簇，通過抗原修復，使得細胞內(nèi)抗原決定簇重新暴露，提高抗原檢測率。常用的修復方式一般分三種：高壓修復、微波修復、酶修復。

a）高壓修復是目前使用較多、較穩(wěn)定、可重復性較高的一種方法，操作簡單，效果較好。但這種方法對修復的溫度和時間要求十分嚴格。我們常用的高壓鍋修復，溫度在110℃左右，修復時間為2.5min。

b）微波修復是較早采用的熱抗原修復技術(shù)，其方法受環(huán)境因素影響較大。微波修復偶爾也會出現(xiàn)同時修復的組織切片中以及同一切片的不同部位可能會出現(xiàn)修復效果不均勻的現(xiàn)象。比較適合高pH值的抗原修復液（EDTA、EGTA）修復。

c）酶修復法比較溫和，常用于脫片現(xiàn)象較嚴重的切片（如骨組織切片）。常用的酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。酶消化法進行抗原修復，須嚴格控制濃度和作用時間，消化不足，不能充分暴露出組織抗原；過度的消化會破壞組織結(jié)構(gòu)，陽性定位不明確。我們常用蛋白酶K修復，條件為37℃ 10min。

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內(nèi)源性過氧化物酶會與基質(zhì)溶液（過氧化氫和顯色劑，例如DAB）發(fā)生反應(yīng)，導致假陽性。在與HRP偶聯(lián)抗體一起孵育之前，先用過氧化氫預處理樣本可以顯著降低這種非特異性背景。滅活內(nèi)源性過氧化物酶一般用3%過氧化氫孵育10min左右。

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