干貨|ELISA實驗做不好，索萊寶FAQ來幫你

更新時間：2021-01-15

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2020年就像一列疾馳的列車，雖然經(jīng)歷彷徨、迷茫，但終于駛過寒冬，駛向春天。2021帶著我們美好的愿望如期而至。在新年的伊始，我們?yōu)榇蠹宜蜕狭薊LISA的一些大干貨，趕緊收藏起來吧!

ELISA原理

酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，簡寫ELISA）指將抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，后結(jié)合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的有無深淺定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

ELISA常見分類

直接ELISA

特點：在直接ELISA中，抗原被固定在多孔板表面，用一種針對該抗原的抗體檢測，該抗體直接與HRP或其他檢測分子結(jié)合。

優(yōu)點：簡單快速，避免交叉反應(yīng)。

缺點：潛在高背景，沒有信號放大。

間接ELISA

特點：固相載體包被抗原，酶標記二抗，主要用于測抗體。

優(yōu)點：使用酶標二抗增加了靈敏度，靈活度大，成本低。

缺點：交叉反應(yīng)幾率升高。

用途：通過檢測血清中的抗體來檢測病毒，如第1，2代艾滋病診斷試劑。于免疫動物血清中抗體含量的測定。

雙抗夾心ELISA

特點：使用兩個特異性單抗或者1個特異性單抗和1個特異性多抗，固相載體包被抗體，酶標記特異性抗體作為檢測抗體。

優(yōu)點：使用兩個特異性抗體檢測，特異性好。

缺點：成本高。

用途：用于抗原的定量檢測。

競爭ELISA

特點：包被抗體，標記抗原，樣本中的抗原與酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合，標本中抗原含量越多，結(jié)合在固相上的酶標抗原越少，后的顯色也越淺。

缺點：整體的敏感性和專一性都較差。

用途：小分子抗原或者半抗原的定量檢測，當(dāng)抗原材料中干擾物質(zhì)不易去除或不易得到足夠的純化抗原時，多用于此方法檢測；一般小分子激素及藥物常用此法測定。

ELISA常見問題

為什么推薦雙波長檢測(450nm和630nm)？

A：ELISA實驗終止后形成的是黃色物質(zhì)，該物質(zhì)需要在450nm處測定其吸光度，630nm的吸光度只是檢測板子本身的吸光度，與酶標板的材質(zhì)有關(guān)，測OD630可以消除各個板孔不干凈等非特異性因素引起的誤差。如果所使用的酶標儀不可以檢測OD630也沒有關(guān)系，只讀取OD450的結(jié)果也可以。

數(shù)據(jù)處理時所用的矯正值，是把所有孔的OD值減去標準曲線0濃度孔的OD值，進一步計算結(jié)果。

CV值指的是什么？

A：CV值是統(tǒng)計學(xué)中的一個概念，中文是變異系數(shù)，可以認為變異系數(shù)和極差、標準差和方差一樣，都是反映數(shù)據(jù)離散程度的值。CV值越小，說明數(shù)據(jù)的波動程度越小。在描述板內(nèi)、板間實驗結(jié)果是否一致時常用到CV值，其越小，說明批內(nèi)及批間差越小，試劑盒質(zhì)量越好。

標曲擬合方式的方法？

A：ELISA數(shù)據(jù)處理中所謂的“標準曲線”其實稱為擬合曲線比較合適。標準曲線的擬合方式有多種，直線、二次曲線、三次曲線、指數(shù)、對數(shù)等雖都可用于ELISA及其它生物學(xué)反應(yīng)中的曲線擬合，但都只適用于曲線的一部分，有的適用于前半段，有的適用于后半段，有的適用于中間一段，而四參數(shù)Logistic曲線擬合則對曲線的全部都有較好的適用性。目前上的免疫檢測擬合方式是“四參數(shù)Logistic擬合"，用這種擬合方式往往能夠比較的反映濃度和吸光度的曲線關(guān)系，從而進一步比較正確地獲得樣品中待測物質(zhì)的濃度值。

建議用專門的軟件進行數(shù)據(jù)處理，這樣可以快速、準確地計算出結(jié)果。

明確標明種屬的試劑盒可以用來檢測其他

種屬的樣本嗎？

A：ELISA試劑盒嚴格區(qū)分種屬，一般不推薦跨種屬檢測，不同種屬的同一個指標同源性相差可能會很大，抗體的特異性要求比較高，不同種屬樣本與抗體結(jié)合能力會有很大差別。

ELISA試劑盒只能檢測血清、血漿、細胞

上清液嗎？

A：通常我們可用于ELISA檢測的樣本是有多種類型的，包括血清、血漿、細胞上清等常規(guī)樣品，而對于尿液、細組織勻漿液、細胞裂解液等樣品，目前市面上很多廠家的產(chǎn)品都沒有相關(guān)的驗證數(shù)據(jù)，理論上可以檢測，客戶如有需要可以自行測試。需要注意的是，不同類型的檢測樣本前期的處理方法是不一樣的。樣品中含有影響生物活性的物質(zhì)會影響檢測結(jié)果。

試劑盒在使用前要室溫放置30min，目的

是什么？

A：ELISA試劑盒對于溫度的要求比較嚴格，溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素，這樣做主要是為了使試劑溫度一致，在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地滿足測定要求。

樣本收集后不能及時檢測，低溫保存可以

放多久？

A：樣本收集后24之內(nèi)進行檢測，放在4℃冰箱即可。如果樣本收集后不能立即檢測，需將樣本置于低溫冰箱中，樣本3個月內(nèi)檢測可于-20℃保存，若需存放時間更久，需要-80℃冰箱保存。

樣品反復(fù)凍融影響大嗎？

A：樣品反復(fù)凍融對蛋白影響非常大，能導(dǎo)致蛋白降解，非常不建議反復(fù)凍融樣品。一般蛋白含量豐富的樣本例如血清/血漿反復(fù)凍融1-2次，對于檢測結(jié)果影響不是非常大，但是其他類型的樣本，例如細胞上清液、肺泡灌洗液，反復(fù)凍融會使蛋白降解嚴重，對檢測結(jié)果影響非常大。

生物素化抗體和酶結(jié)合物，稀釋后沒用完，

還可以再用嗎？

A：稀釋后的生物素化抗體和酶結(jié)合物建議在當(dāng)天用完，放置時間太長可能會影響其活性?？筛鶕?jù)自己實驗所需用量進行配制，不建議過量配制。

Q10

變異系數(shù)(CV)較大的原因？

A：