在免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常需要將抗體標(biāo)記上酶或者熒光素，大部分科研工作者一提到
FITC熒光標(biāo)記抗體往往會(huì)很畏懼，主要原因是不知道如何下手，參照一些文獻(xiàn)的方法和步驟做出來(lái)的結(jié)果往往不盡如人意，往往讓實(shí)驗(yàn)人員畏而束手。
FITC熒光素是目前較為常用的標(biāo)記抗體的方法，F(xiàn)ITC一般呈黃色、褐色或褐黃色粉末或結(jié)晶，性質(zhì)穩(wěn)定在低溫中能保存數(shù)年。在堿性條件下，F(xiàn)ITC的碳酰胺鍵可與抗體蛋白上的賴氨酸氨基共價(jià)結(jié)合，形成FITC-蛋白質(zhì)結(jié)合物，即熒光抗體或熒光結(jié)合物。一個(gè)FITC熒光標(biāo)記抗體分子上能標(biāo)記15~20個(gè)FITC分子，被標(biāo)記的抗體仍能保持與相應(yīng)抗原結(jié)合的能力，在熒光燈源紫外線或藍(lán)紫光激發(fā)下產(chǎn)生黃綠色熒光，通過(guò)熒光顯微鏡進(jìn)行觀察或利用流式細(xì)胞儀分析，從而對(duì)抗原進(jìn)行定性、定位或定量。
FITC熒光標(biāo)記抗體的標(biāo)記方法主要有Marshall直接標(biāo)記法、Chadwick間接標(biāo)記法、改良標(biāo)記法和透析法四種。下面，北京索萊寶科技小編將為大家主要講解Marshall直接標(biāo)記法、Chadwick間接標(biāo)記法，希望可以幫助到大部分科研工作者。
一、Marshall直接標(biāo)記法
1、抗體的準(zhǔn)備：取提純的Ig溶液測(cè)定蛋白質(zhì)含量，置于三角燒瓶中加入生理鹽水和0.5mol/LpH9.5碳酸鹽緩沖液，冰槽中攪拌5~10min；
2、熒光素的準(zhǔn)備：按每毫克蛋白質(zhì)加0.01~0.02mg的FITC計(jì)算，準(zhǔn)確稱取后加入抗體溶液中；
3、標(biāo)記：邊攪拌邊加入熒光素，避免粉末黏附于壁上，置于4℃冰箱或冰庫(kù)繼續(xù)攪拌12~18h；
4、透析：結(jié)合完畢后，先將結(jié)合物以3000r/min離心20min，除去少量沉淀物后裝入透析袋中再置于pH8.0緩沖鹽的燒杯中透析過(guò)夜；
5、過(guò)柱：取透析過(guò)夜的標(biāo)記物，過(guò)葡聚糖凝膠G-25或G-50柱，分離游離的FITC，收集標(biāo)記的FITC熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行鑒定。
二、Chadwick間接標(biāo)記法
1、抗體的準(zhǔn)備：0~4℃下，用0.01mol/LpH8.0PBS將待標(biāo)記的抗體蛋白溶液稀釋到濃度為30~40mg/ml，置于三角燒瓶?jī)?nèi)放入冰槽中；
2、熒光素的準(zhǔn)備：按每毫克蛋白質(zhì)加入0.01mg的熒光素稱取，溶解于等量的3%重碳酸鈉水溶液中；將抗體蛋白溶液與FITC溶液等量混合，在0~4℃中攪拌18~24h，充分?jǐn)噭颍?/div>
3、透析或過(guò)柱層析。
這里需要注意FITC熒光標(biāo)記抗體的操作過(guò)程注意避光，攪拌速度應(yīng)適當(dāng)避免氣泡的產(chǎn)生；層析柱裝柱注意正確操作，使柱體均勻、柱面平整，無(wú)氣泡、裂隙。
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更新時(shí)間：2020-12-07
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